共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁工藝的優(yōu)化

安玉紅， 陸敏濤， 黎代余 ， 黃 燕 ， 彭永賢

(1.畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 畢節(jié) 551700； 2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽550025)

刺梨(Rosaroxbunghii)為薔薇科(Rosaceae)多年生落葉灌木繅絲花的營養(yǎng)珍果，是我國貴州、云南、四川等西部山區(qū)特有的野生植物，其中以貴州最多，全省除威寧縣尚未發(fā)現(xiàn)刺梨外，其他各區(qū)縣均有分布[1]。目前，貴州省刺梨栽培面積已在330萬hm2以上，全省鮮果年產(chǎn)量1 500萬kg以上，居全國之首[2]，刺梨已成為貴州省重點(diǎn)發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)之一。刺梨是集食用、藥用、保健和觀賞為一體的綠色特新水果[3]，其果汁中富含大量維生素、植物多糖、單寧類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等活性成分[4-8]，且無急性、慢性毒性，可長期安全食用[9]。

目前，市場上的刺梨產(chǎn)品主要有刺梨汁、刺梨飲料、刺梨果干、果脯和果酒等[10]。其中，刺梨汁因其具有抗氧化[11-13]、解酒護(hù)肝[9]和降血糖血脂[14-16]等功效，越來越受人們青昧。但刺梨汁在貯藏過程中極易產(chǎn)生褐變和絮狀渾濁物等現(xiàn)象，影響商品性狀，嚴(yán)重限制刺梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，已報道的刺梨汁澄清方法有機(jī)械澄清法[17]、自然澄清法[18]、超濾澄清法[19]、JA澄清法[20]和甲殼素類法[21]等，貴州省刺梨汁加工的澄清方法主要采用明膠單寧法或殼聚糖單寧法，該方法操作簡單，既能脫澀，還具有很好的澄清效果，但需靜置20 h以上，在此過程中刺梨汁褐變嚴(yán)重、安全風(fēng)險增加、營養(yǎng)損失大、設(shè)備利用率低、不可連續(xù)化生產(chǎn)[21]。生物技術(shù)或酶工程技術(shù)因其作用條件溫和、時間短、操作性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于果汁、果酒和飲料[22-23]等澄清處理中。而直接使用游離酶制劑存在成本較高和回收難等問題，隨著酶工程的逐步成長，固定化酶在一定水平上填補(bǔ)了這一缺陷[24]。以殼聚糖為載體制得的固定化酶，化學(xué)穩(wěn)定性高，機(jī)械性能好且容易回收，殼聚糖作為自然陽離子澄清劑，可以和果漿中蛋白質(zhì)、果膠和纖維素等帶負(fù)電荷物質(zhì)互相作用[25-26]。果膠酶大致分為果膠裂解酶 (pentinlyases, PL)、果膠水解酶(pectinhydrolases)、果膠酯酶(pectinesterases, PE)和原果膠酶等。果膠水解酶又分為聚半乳糖醛酸甲酯水解酶(polymethylgalacturonases, PMG)、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)等。其中PL只能裂解貼近甲酯基的α-1,4糖苷鍵，而PG降解果膠為小分子，并使其還原末端暴露[27]。由于不同的果品蔬菜其果膠含量、成分差異較大。因此，在使用時應(yīng)根據(jù)加工目的、品種來選擇果膠酶的酶組成。因PG的專一性對果膠的酯化度要求不如PL高，在提高榨汁率時通常選用PL，在澄清果汁時以PG為主。果纖維素酶不僅能提高果蔬的出汁率和可溶性固形物含量，而且能改善部分果蔬汁的品質(zhì)[28]。諶國蓮等[29]研究表明，果膠酶、纖維素酶等酶聯(lián)合使用，顯著提高荔枝澄清度、穩(wěn)定性和果汁品質(zhì)。目前，鮮見果膠酶和纖維素酶聯(lián)合使用刺梨汁的報道，因此，研究共固定化果膠酶和纖維素酶對刺梨汁的澄清效果，以期為生產(chǎn)高品質(zhì)的刺梨汁提供參考。

1材料與方法

1.1材料

刺梨汁：由貴州奇昂生物科技有限公司提供。

試劑：果膠酶(酶活力10 U/g)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。羧甲基纖維素鈉(CR)，國藥集團(tuán)；果膠﹝半乳糖醛酸(干基計(jì)) ≥74.0 %〕，廣州萬邦有限公司。纖維素酶(酶活力10 U/g)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；殼聚糖(脫乙酰度90%)，上海伯奧生物科技有限公司；SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所；試驗(yàn)用其他試劑，均為分析純。

儀器與設(shè)備：H1-16KR高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；YP 3001 N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DY89-II電動玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RYC-111恒溫?fù)u床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L5S紫外-可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；手持糖度儀，上海勃基儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1殼聚糖共固定化復(fù)合酶的制備參考文獻(xiàn)[30-32]的方法進(jìn)行，準(zhǔn)確稱取殼聚糖10 g，用1%乙酸充分溶解后，并用1%乙酸定溶至500 mL，靜置2 h。用5 mL注射器逐滴加入到溶于1 000 mL 1 %乙酸溶液中，經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，溶解后靜置到氣泡消失。將上述溶液用5 mL的注射器逐滴加入到1 250 mL混合液(10% NaOH與95%乙醇，體積比為4∶1)中，并在4 ℃條件下放置12 h后，滴入少許5%戊二醛，攪拌后靜置6 h。抽濾，蒸餾水洗滌至中性，用吸水紙吸干表面水分，加入纖維素酶和果膠酶的酶液，搖床振蕩固定化(4℃，6 h)后，用蒸餾水洗去未固定的酶，再抽干即得固定化復(fù)合酶，收集微球，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2刺梨汁透光率最佳波長的測定量取少量已加入固定化復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶=3∶1)的刺梨汁，分別在波長為50 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm和800 nm下，用分光光度法，測定刺梨汁的吸光度，用最佳波長處的透光率(T，%)表示刺梨汁的澄清度[30]。

1.2.3單因素試驗(yàn)

1) 復(fù)合酶比例篩選。量取1 000 mL刺梨汁，加入質(zhì)量比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的果膠酶和纖維素酶制備殼聚糖固定化復(fù)合酶微球，在50℃水浴下反應(yīng)60 min，測其透光率。

2) 共固定化復(fù)合酶的添加量。量取1 000 mL刺梨汁，加入果膠酶∶纖維素酶為 3∶1的殼聚糖固定化果膠酶和纖維酶的微球，添加量分別為5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L和40 g/L，在50℃水浴下反應(yīng)60 min，測其透光率。

3) 酶解時間。量取1 000 g/L刺梨汁，加入果膠酶∶纖維素酶為3∶1的殼聚糖固定化果膠酶和纖維酶的微球，添加量為20 g/L，在50℃水浴下反應(yīng)40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min和100 min后，分別測其透光率。

4) 酶解溫度。量取1 000 mL刺梨汁，加入果膠酶∶纖維素酶為3∶1的殼聚糖固定化果膠酶和纖維酶的微球，添加量為20 g/L，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴下反應(yīng)70 min后，分別測其透光率。

1.2.4正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對加酶量、酶解時間、酶解溫度 3個因素，進(jìn)行3因素3水平的L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，以確定固定化最優(yōu)條件。

表1 共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁的正交試驗(yàn)因素及水平

Table 1 Factor and level of orthogonal test for clarifyingR.roxbunghiijuice by co-immobilized complex enzyme

因素Factor加酶量(A)/(g/L)Enzyme amount酶解時間(B)/minEnzymolysis time酶解溫度(C)/℃Enzymolysis temperature110655022070553307560

1.2.5刺梨汁澄清前后營養(yǎng)成分的測定多酚的測定采用Folin-Ciocalteau法進(jìn)行測定[33]；總黃酮采用硝酸鋁—醋酸鉀法[34]；VC采用鉬藍(lán)比色法分析[35]；SOD采用羥胺法，具體步驟參見試劑盒。

1.2.6共固定化復(fù)合酶的穩(wěn)定性試驗(yàn)將共固定化復(fù)合酶進(jìn)行連繼10次重復(fù)使用，并測定每次的刺梨汁透光率。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以 平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間差異顯著性采用 SPSS 22.0分析，各組間比較采用單因素方差分析，用Duncan法分析顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1刺梨汁透光率的最佳波長

由圖1可知，隨著波長的增加，刺梨汁透光率先增加后保持不變，其中650 nm時其透光率為77.12%，之后其透光率基本保持不變，所以確定刺梨汁透光率最佳波長為650 nm。

2.2不同因素對刺梨汁透光率的影響

從圖2可知，不同果膠酶與纖維素酶比例、固定化復(fù)合酶添加量、酶解溫度和酶解時間對刺梨汁透光率有不同的影響。

2.2.1果膠酶和纖維素酶比例隨著果膠酶與纖維素酶比例的增加，刺梨汁的透光率呈先增后減趨勢，其中果膠酶∶纖維素酶為3∶1時，刺梨汁的透光率顯著高于其他比例；當(dāng)其質(zhì)量比為4∶1和5∶1時，刺梨汁的透光率減小。可能因?yàn)楣z酶質(zhì)量濃度增加時，抑制了纖維素酶的活性，導(dǎo)致透光率降低。故果膠酶∶纖維素酶宜為3∶1。

圖1 刺梨汁透光率與波長的關(guān)系

Fig.1 Relationship between light transmittance and wavelength ofR.roxbunghiijuice

注：不同小寫不同表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significance of difference atP<0.05 level.

圖2 不同因素下刺梨汁的透光率變化

Fig.2 Variation in light transmittance ofR.roxbunghiijuice under different factors

2.2.2固定化復(fù)合酶添加量隨著固定化復(fù)合酶添加量的增加，刺梨汁的透光率呈先增后降趨勢，當(dāng)添加量為20 g/L時，其透光率最高，為78.09%?？赡苁菑?fù)合酶添加量的增加，水解完相應(yīng)底物后，未反應(yīng)完全的酶影響其透光率。

2.2.3酶解溫度隨著溫度的升高，刺梨汁的透光率呈先增后降趨勢，在50℃時，刺梨汁的透光率達(dá)80.04%；在50℃后，刺梨汁的透光率隨著溫度的升高而降低?？赡芘c果膠酶和纖維素酶的最適溫度有關(guān)，溫度過高或過低，均影響酶的活性。

2.3.4酶解時間隨著酶解處理時間的延長，刺梨汁的透光率呈先增后降趨勢，處理70 min時的透光率最高，為78.55%。這是因?yàn)榇汤嬷须m含VC含量高，但多酚類物質(zhì)含量也非常豐富，在50℃水浴中進(jìn)行酶解，其氧化速度會加快，當(dāng)酶解時間超過70 min后，底物基本完全酶解，與多酚類物質(zhì)競爭氧分子的底物減少，使其酶促褐變加快，影響刺梨汁的透光率。

2.3共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁的工藝優(yōu)化

由表2可知，不同因素對固定化果膠酶和纖維素酶澄清刺梨汁影響的順序?yàn)镃>A>B；其最優(yōu)水平為A2B2C2。正交試驗(yàn)方差分析表明，加酶量、酶解時間和酶解溫度皆可顯著影響固定化果膠酶和纖維素酶對刺梨汁澄清的作用。共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁的最佳工藝為果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比3∶1、酶添加量為20 g/L，酶解時間70 min，酶解溫度55℃，在該條件下，刺梨汁透光率可達(dá)86.45%。

表2 共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁正交試驗(yàn)各處理的透光率

Table 2 Light transmittance ofR.roxbunghiijuice clarified by co-immobilized complex enzyme

處理Treatment加酶量(A)/(g/L)Enzyme amount酶解時間(B)/minEnzymolysis time酶解溫度(C)/℃Enzymolysis temperature111121223133421252236231731383219332K1208.44211.09188.69K2230.36227.33237.33K3203.42203.80216.20k169.4870.3662.90k276.7975.7879.11k367.8167.9372.07R8.987.8416.21優(yōu)水平 A2B2C2 Optimum level

2.4處理前后刺梨汁功能性成分含量

由表3可知，殼聚糖固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁對其主要營養(yǎng)物質(zhì)的影響各有差異，導(dǎo)致刺梨汁混濁的多酚、水溶性蛋白質(zhì)含量顯著(P<0.05)下降，分別下降14.32%和11.57%，這是因?yàn)槎鄶?shù)水溶性蛋白質(zhì)和少數(shù)酚類物質(zhì)會隨殼聚糖的絮凝性能和果膠酶及纖維素酶的分化功能而沉降[37]。刺梨汁中VC、SOD和總黃酮含量有下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，分別下降5.01%、6.13%和7.23%。說明殼聚糖固定化果膠酶及纖維素酶澄清能較好地保存刺梨汁中的主要功能性物質(zhì)。

表3 處理前后刺梨汁功能性成分含量

Table 3 Functional component content ofR.roxbunghiijuice before and after treatment

項(xiàng)目Item酶解前Before enzymolysis酶解后After enzymolysis多酚/(mg/mL) Phenols126.44±8.43 a108.33±6.65 b總黃酮/(mg/mL) Total flavones8.44±0.76 a7.83±0.59 aVC/(mg/mL)2218.33±10.22 a2106.72±12.32 aSOD(U/mL)186.33±7.90 a174.91±5.19 a水溶性蛋白質(zhì)(μg/mL)44.32±3.23 a39.19±4.19 b Water soluble protein

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same row indicate significance of difference atP<0.05 level.

2.5共固定化復(fù)合酶的穩(wěn)定性

由圖3可知，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，刺梨汁的透光率逐漸下降，可能是與殼聚糖固定化酶失活有關(guān)。連續(xù)使用10次后，刺梨汁的透光率仍達(dá)74.11%，說明該固定化酶具有一定的操作穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明，共固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁的最佳工藝為殼聚糖固定化果膠酶與纖維酶的質(zhì)量比3∶1、酶添加量20 g/L、酶解時間70 min、酶解溫度55℃，在此工藝條件下，刺梨汁透光率達(dá)86.45%。殼聚糖固定化復(fù)合酶澄清刺梨汁可顯著降低導(dǎo)致刺梨果汁混濁的多酚和水溶性蛋白質(zhì)含量，分別下降14.32%和11.57%，而對刺梨汁中VC、SOD和總黃酮的影響不顯著。