日本莢蒾ITS序列的克隆與分析

應夢豪, 馬佳瑩, 鄔張穎,戴晨宇, 徐麗娜, 楊如棉, 朱 欣, 李彥蓉, 蔣 明

(臺州學院 生命科學學院, 浙江 椒江 318000)

莢蒾屬(Viburnum)植物為忍冬科(Caprifoliaceae)灌木或小喬木，落葉或常綠[1]。全世界約有莢蒾屬植物200種，大部分種類分布于亞洲和南美洲；我國有70多種，各省區均有分布[2]。莢蒾屬植物花冠潔白，偶見淡紅色，具有一定的觀賞價值，目前在園林綠化和美化中得到了較為廣泛的應用。莢蒾屬有些植物具放射狀大型不孕花，有較高的觀賞價值，部分物種已應用于園林綠化或美化；有些種類具有較高的藥用價值，如天目瓊花(V.opulusvar.calvescens)、宜昌莢蒾(V.erosum)、球核莢蒾(V.propinquum)和茶莢蒾(V.setigerum)等，其根、莖、葉或果實均可入藥，含萜類、黃酮類和香豆素等；此外，莢蒾屬植物在釀酒與食品工業有一定的應用，可用于制作果醬、糕點和飲料等[1, 3]。日本莢蒾(V.japonicum)為常綠灌木或小喬木，分布于浙江省的上大陳島、雀兒岙島和東福山島等，在日本和韓國也有少量分布，由于數量十分稀少，日本莢蒾已被列為浙江省極小種群拯救物種[4-7]。

有關日本莢蒾的研究主要集中在扦插繁殖、光合特性和生理生化等方面[8-10]，而該物種分子生物學方面的研究鮮見報道。用于植物研究的分子手段主要有SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態性)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長度多態性)、SSR(Simple Sequence Repeats，簡單序列重復)和rDNA ITS(Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，核糖體DNA內轉錄間隔區)等。植物rDNA ITS由位于18S與5.8S之間的ITS1和位于5.8S與28S之間的ITS2組成，其中，ITS1和ITS2序列受環境選擇壓力較小，能保持較高的變異，已成為種質資源鑒定、系統發育分析和植物分類研究的重要分子標記[11]。目前，有關日本莢蒾rDNA-ITS序列的研究鮮見報道。為此，以日本莢蒾為材料，在克隆rDNA ITS序列的基礎上，進行序列分析和比對，以明確序列特征和系統發育地位，為日本莢蒾的分子鑒定和遺傳多樣性研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

日本莢蒾的葉片，采自浙江臺州上大陳島。采集3個單株，將葉片置于冰盒帶回實驗室。先用大量自來水沖洗，再用無菌水浸泡后擦干，保存于-80℃的超低溫冰箱備用。

儀器： C1000型PCR儀，美國伯樂； Gel Doc XR+凝膠成像系統，美國伯樂； DYY-12型電泳儀和電泳槽，北京六一；日本SANYO MDF-382E型超低溫冰箱等。

試劑：DNA凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP等購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；pEASY-T1載體和DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取葉片加液氮磨成粉末，利用SDS法提取基因組DNA。DNA樣品經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用伯樂Gel Doc XR+凝膠成像系統拍照記錄，DNA樣品置于-20℃冰箱備用。

1.2.2ITS序列的PCR擴增根據NCBI中歐洲莢蒾(V.opulus)(KY860934.1)和櫻葉莢蒾(V.prunifolium)(KY860928.1)的ITS序列設計PCR引物擴增日本莢蒾的ITS全長。引物序列分別為RBJMCUP(5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3′)和RBJMCDN(5′-CGCTTATTGATATGCTTAAACTCAGCG-3′)。PCR擴增在C1000型PCR儀上進行，在PCR管中依次加入16.1 μL ddH2O、2.0 μL 10×緩沖液、0.6 μL dNTPs(10 mM)、0.2 μL上、下游引物(20 μM)、0.5 μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL)和0.4 μL基因組DNA(80 ng/μL)。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60.1℃退火1 min，72℃延伸90 s，共33個循環；72℃最后延伸10 min。

1.2.3PCR產物的回收、連接和測序PCR產物采用DNA凝膠回收試劑盒回收，操作根據說明書進行。取5 μL回收產物，與pEASY-T1載體連接，置于4℃冰箱約10 h，導入DH5α感受態細胞。經涂布、挑單菌落、液體培養和菌液PCR檢測后，挑取3份陽性克隆的菌液用于測序。

1.2.4序列分析從NCBI數據庫下載17條同源序列進行比對分析，分別是櫻葉莢蒾(V.prunifolium)、醉魚草狀莢蒾莢蒾(V.buddleifolium)、聚花莢蒾(V.glomeratum)、皺葉莢蒾(V.rhytidophyllum)、金佛山莢蒾(V.chinshanense)、陜西莢蒾(V.schensianum)、鱗斑莢蒾(V.punctatum)、蒙古莢蒾(V.mongolicum)、宜昌莢蒾(V.erosum)、莢蒾(V.dilatatum)、美國瓊花(V.opulusvar.americanum)、雞條樹(V.opulusvar.calvescens)、短芽莢蒾(V.brachybotryum)、珊瑚樹(V.odoratissimum)、粉團(V.plicatum)、顯脈莢蒾(V.nervosum)和克氏莢蒾(V.clemensiae)。采用DNAMAN軟件統計GC值；利用ClustalX 1.81進行序列比對；采用MEGA 3.1計算遺傳距離和構建系統發育樹，構建方法為鄰接法，經1 000 次自舉檢測[12-13]。

2結果與分析

2.1ITS序列PCR產物與序列

電泳結果表明，ITS-PCR產物的條帶位于約600 bp處，條帶單一、清晰，可用于割膠與回收(圖1)。經回收、連接、轉化和測序，得到ITS序列。測序結果表明，各樣品的ITS序列完全一致。日本莢蒾的ITS全長617 bp，大小與預期一致(圖2)。

M：DNA標準分子量；1：ITS-PCR產物。

M: DNA Marker; 1: ITS-PCR product.

圖1 ITS-PCR產物的電泳結果

Fig.1 Electrophoresis results of ITS-PCR products

2.2ITS序列的特征

18種莢蒾屬植物ITS全長607～617 bp，其中日本莢蒾ITS序列最長，宜昌莢蒾和鱗斑莢蒾次之，為615 bp，短芽莢蒾和粉團的ITS序列最短，分別為608 bp和610 bp。除宜昌莢蒾的5.8S序列長度為163 bp外，其余植物的5.8S均為164 bp。莢蒾屬植物的ITS1序列長度為224～230 bp，鱗斑莢蒾的ITS1序列最長，為230 bp；ITS2序列長度為219～227 bp，日本莢蒾的ITS2序列最長，為227 bp；宜昌莢蒾次之，為225 bp；醉魚草狀莢蒾、聚花莢蒾、皺葉莢蒾、陜西莢蒾、蒙古莢蒾、短芽莢蒾和粉團的ITS2序列最短，均為219 bp。莢蒾屬植物ITS1、5.8S和ITS2序列的GC 分別為59.8%～70.7%、50.0%～54.6%和53.4%～71.0%，其中日本莢蒾ITS1、5.8S和ITS2的GC分別為67.7%、54.2%和69.6%(表1)。

表1 18種莢蒾屬植物ITS序列信息

2.3ITS序列的多重比較

18種莢蒾屬植物的ITS序列變異豐富，其中ITS1上含86個變異位點和41個信息位點，分別占總位點數的37.39%和17.83%。聚花莢蒾、皺葉莢蒾和醉魚草狀莢蒾3種植物ITS1序列的組成和長度完全一致。鱗斑莢蒾ITS1序列較其他17種莢蒾屬植物長，為18種植物中發生堿基插入最多的植物，共發生了6次堿基插入，分別在+57、+88、+89、+90、+91和+92處，其中3次為C堿基的插入，2次為G堿基的插入，1次為T堿基的插入。莢蒾在+188處發生堿基的缺失，另一缺失發生在+219處，美國瓊花和雞條樹在該位點有C堿基的缺失。金佛山莢蒾在+21處存在轉換，其在該位點的堿基為T，其余植物為C。C→T轉換現象發生在+13、+21、+28、+98、+109和+220等位點，而A→G轉換發生在+46、+53、+115、+124、+198和+200等位點。顛換現象發生在+39、+42、+102、+107、+119和+213等位點(圖3)。與其他序列相比，日本莢蒾的ITS1共有12處變異，分別在+41、+45、+52、+53、+65、+127、+190、+204、+214、+218、+220和+229處：在+41、+45、+52、+65、+190、+220和+229發生了C→T轉換，而A→G轉換僅發生在+53處，日本莢蒾在該位點的堿基為G；+127、+204和+218處存在著堿基顛換，+214處發生了G堿基的插入；其中在+52和+127處僅日本莢蒾存在變異，分別發生了C→T轉換和C→A顛換。

2.4系統發育

18種莢蒾屬植物的遺傳距離在0～0.124，平均遺傳距離為0.062。其中，鱗斑莢蒾和金佛山莢蒾的遺傳距離最大，為0.124；醉魚草狀莢蒾、聚花莢蒾和皺葉莢蒾三者間的遺傳距離相同，均為0；日本莢蒾與金佛山莢蒾的遺傳距離最大，為0.114，親緣關系最遠，與宜昌莢蒾遺傳距離最小，為0.015，親緣關系最為接近。采用鄰接法構建系統進化樹，結果表明，18種莢蒾屬植物在系統發育樹上可分為6組：金佛山莢蒾、聚花莢蒾、醉魚草狀莢蒾和皺葉莢蒾聚為一組；陜西莢蒾和蒙古莢蒾單獨聚為一組；日本莢蒾、莢蒾、宜昌莢蒾、美國瓊花和雞條樹聚為一組；克氏莢蒾、顯脈莢蒾、粉團、短芽莢蒾和珊瑚樹聚為一組，鱗斑莢蒾和櫻葉莢蒾聚為一組；外類群忍冬單獨聚為一組(圖4)。

3結論與討論

真核生物rDNA的18S、5.8S和28S序列在進化上十分保守，而其間的ITS序列則能保留較多的變異，具有結果穩定和重復性高等優點，廣泛應用于遺傳多樣性、親緣關系分析和系統發育等方面[13-14]。李金博等[15]利用ITS研究15個白三葉(Trifoliumrepens)品種的遺傳多樣性，可將其分為三大類，可用于遺傳多樣性分析。羅小珍等[16]以產于廣西的6種十大功勞屬(Mahonia)植物為材料，研究其間親緣關系發現，闊葉十大功勞(M.bealei)、小果十大功勞(M.bodinieri)和十大功勞(M.fortunei)之間的關系最為接近。李建強等[17]對水青岡屬(Fagus)6種、1變種和1栽培變種的ITS片段進行分析發現，與形態學分類存在一定的差異，而與地理分布格局較為一致。王曉鋒等[18]測定黃楊屬(Buxus)的ITS序列認為，珍珠黃楊(B.sinicavar.parvifolia)并非瓜子黃楊(B.sinica)的變種，珍珠黃楊與大花黃楊(B.henryi)的親緣關系相對較近。研究以日本莢蒾為材料，在克隆其ITS序列的基礎上，構建了同屬植物的系統發生樹，發現其與宜昌莢蒾處于同一分支，支持率達99%。

ITS1和ITS2在進化中所受的壓力較小，可產生豐富的變異和信息位點。蔣明等[19]通過測定11種石豆蘭屬(Bulbophyllum)植物的ITS序列表明，ITS1和ITS2間存在豐富的變異位點，可以用于石豆蘭屬植物的分子鑒定。樊杰等[20]克隆遠志屬(Polygala)7種植物的ITS序列結果顯示，ITS1和ITS2序列的變異位點/信息位點分別為144/35個和88/18個，可用于區分遠志屬7種藥用植物。吳琦等[21]利用ITS對2份金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)樣品進行PCR擴增發現，2份金蕎麥ITS序列分別檢測到80個和66個多態性位點，可把兩者區分開來。日本莢蒾和17種莢蒾屬植物的ITS1與ITS2的變異位點各分別為86個和74個，其中信息位點分別為41個和29個，這些位點可用于鑒別此類植物。與ITS1和ITS2相比，5.8S為編碼區，序列長度和組成較為保守。宜昌莢蒾的5.8S長度為163 bp，而日本莢蒾和其他莢蒾屬植物的5.8S均為164 bp。在山茶屬(Camellia)植物中，除少數植物的5.8S有堿基缺失外，其余5.8S的長度均為164 bp[22]。而當歸屬(Angelica)21種植物的5.8S長度完全一致，均為165 bp[23]。

在克隆珍稀植物日本莢蒾rDNA ITS的基礎上，與17種莢蒾屬植物的ITS比較分析結果表明，日本莢蒾的ITS全長為617 bp，ITS1、ITS2和5.8S序列長度分別為226 bp、227 bp和164 bp；莢蒾屬植物ITS1和ITS2的變異位點各有86個和74個，其中信息位點分別為41個和29個；日本莢蒾和宜昌莢蒾之間的親緣關系最近，在發育樹上處于同一分支，支持率達99%。