改進TRIzol法提取不同發育時期海葵的總RNA

袁 琳， 代亞坤， 高炳淼

(海南醫學院 藥學院/熱帶轉化醫學教育部重點實驗室/海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室， 海南 海口 571199)

海葵(Sea anemone)又名海菊花，屬腔腸動物門珊瑚蟲綱六放珊瑚亞綱海葵目[1]，是原始海洋生物。現代藥理研究表明，海葵毒素具有免疫調節、抗菌、降血壓[2]、強心[3]、抗寄生蟲[4]和抗腫瘤[5]等藥理活性。海葵資源的研究前景廣闊，不僅可食用、藥用，還可向化工、飼料、農藥、化妝品等方向轉化和應用[6]。獲得純度高、完整性好的高質量RNA是南海海葵進行分子生物學研究的重要前提[7]，對c DNA文庫構建和轉錄組測序等的深入研究具有重要意義，提高RNA純度及經濟快捷獲得足量的RNA是當前受到關注的問題。

目前，傳統提取RNA的方法有熱酚法[8]、Trizol法[9]、異硫氰酸胍法[10]、氯化胍法[11]、CTAB法、SDS法等，但沒有一種RNA提取方法適用于所有的生物。對海葵的研究主要集中在海葵毒素的提取分離、化學合成、藥理活性等方面，國內少見關于海葵RNA提取分離方面的報道。因此，以南海海葵為研究對象，采用改進TRIzol法[12]提取海葵不同發育時期的總RNA，經瓊脂糖電泳和Agilent 2100生物分析儀檢測 RNA的完整性和純度，獲得海葵純度高、完整性好的高質量RNA,以期為海葵高通量轉錄組測序等分子生物學的深入研究提供基礎，也為其他海洋生物RNA的提取提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品材料不同發育期的海葵，采自南海海域，經鑒定為套膜海葵(Aiptasiapallida)，選擇早中晚3個發育時期的海葵各1只，樣品名稱分別為海葵-小、海葵-中和海葵-大。海葵樣品經去離子水沖洗干凈，于-80℃冰箱冷凍儲存備用。

1.1.2試劑DEPC和TRIzol試劑盒(賽百盛公司)，RNA locker和RNA down(天澤基因工程有限公司)，RNase Inhibitor(TaKaRa公司)，其他試劑均為分析純。

1.1.3儀器Agilent 2100生物分析儀(美國安捷倫公司)，Nano Drop TM 2000分光光度計(Thermo Fisher，USA)，電泳儀(凝膠成像儀為美國伯樂公司)。

1.2方法

1.2.1海葵總RNA的提取采用改進TRIzol一步法提取不同發育期海葵的總RNA[12]。具體步驟：將海葵放入冷的600 μL RNA locker中，靜置1 min后勻漿；將勻漿液充分震蕩，室溫靜置10 min；加入300 μL氯仿，充分震蕩，室溫靜置后離心；異丙醇沉淀 RNA時，加入5 μL的RNA down，再加入500 μL的異丙醇，振蕩后于20℃靜置 30～60 min后離心；75%乙醇洗滌，室溫干燥RNA沉淀；加入適量DEPC處理水(含RNase Inhibitor，終濃度為0.2 U/μL)，4℃下溶解2～6 h后于-70℃保存。

1.2.2總RNA的初步檢測分別取海葵-小、海葵-中、海葵-大RNA樣品與溴酚藍上樣緩沖液混合，加入含Goldview的1.0%瓊脂糖凝膠，180V電泳16 min，然后用凝膠成像儀拍照保存。

1.2.3總 RNA的質量檢測將RNA樣品在冰上融化，混勻后4℃離心。分別取RNA提取液各1 μL，稀釋100倍后，Nano Drop TM 2000分光光度計檢測總RNA的純度(OD260/280)和濃度[13]。Agilent 2100生物分析儀對RNA完整性的質量評估參數，能準確而直觀地評估RNA樣品的質量[13]，并篩選出高質量樣本，因此，采用Agilent 2100生物分析儀自動檢測不同發育時期海葵的總RNA的完整性(RIN值)。質檢等級分為A、B、C 3個等級， A級指質量滿足建庫測序要求，且總量可滿足2次或2次以上建庫需要的樣品；B級指質量滿足建庫測序要求，且總量滿足1次但不足2次建庫需要的樣品；C級指質量/總量不完全滿足建庫測序要求，可以風險建庫，但不保證測序樣品的質量。28S/18S為衡量提取的RNA降解情況及完整性的指標，28S/18S在1.8～2.0則表明所提取RNA基本無降解發生，且完整性較好。

2結果與分析

2.1改進TRIzol法提取海葵總RNA的效果

由圖 1可知，3個發育時期的海葵總RNA的28S和18S條帶清晰，5S條帶模糊。28S條帶較18S條帶更明亮。28S條帶與點樣孔間無明顯亮帶，說明無DNA污染條帶[14]。初步檢測說明，采用改進TRIzol法提取海葵總RNA的瓊脂糖電泳結果較好，改進TRIzol法能有效提取海葵不同發育時期的總RNA。

注：M為低分子量蛋白Marker；1、2和3分別表示海葵-大、海葵-中和海葵-小的總RNA條帶。

Note: M, Marker; 1, 2 and 3 indicate total RNA bands in large, medium and small sea anemones respectively.

圖1 改進TRIzol法提取海葵總RNA的效果

Fig.1 Total RNA extraction from sea anemone by improved TRIzol method

2.2海葵總RNA的質量

從表1可看出改進TRIzol法提取不同發育時期海葵總RNA的質量。

2.2.1濃度改進TRIzol法提取不同發育時期海葵總RNA的濃度以海葵-中最大，為357 ng/μL；海葵-大其次，為335 ng/μL；海葵-小最低，為232 ng/μL。

2.2.2 純度海葵-小、海葵-中和海葵-大總RNA的OD260/280值分別為2.071、1.983和1.981，依據純RNA的標準(1.9

2.2.3完整性海葵-小的RIN值較小，為6.4；28S/18S為1，與1.8～2.0相差較大；質檢等級為C。說明海葵-小的完整性不合格，純度較低，有輕微雜質污染，其質量或總量不完全滿足建庫測序要求，可以風險建庫，但不能保證測序樣品的質量。海葵-中與海葵-大的RIN值分別為7.3和8.8，均大于7；28S/18S分別為2.4和1.9，均大于1.8；質檢等級均為A。說明，海葵-中和海葵-大的總RNA完整性較高，總RNA的質量滿足建庫測序要求，且總量可滿足2次或2次以上建庫需要的樣品，可用于進行后續試驗。

表1 改進TRIzol法提取不同發育時期海葵總RNA的質量

3結論與討論

隨著分子生物技術在生物學、醫學等方面的廣泛應用，RNA提取已成為研究基因表達、克隆目的基因等的一項基本試驗技術。高質量RNA的提取，是后續RT-PCR、Northern blot、c DNA文庫構建等正常進行的必要前提[15]。動物組織RNA的提取技術已非常成熟，已有大量研究者利用各種方法和商業化試劑成功提取高質量的RNA[16-17]。由于RNA非常不穩定，易降解，且RNA酶的存在使得提取完整性好、質量高的RNA變得尤其重要[18]。因此，有效抑制RNA酶活性及去除蛋白質和DNA的污染是獲得高質量RNA的關鍵[19]。熱酚、TRIzol等傳統提取RNA的方法可很好地提取微生物和動物組織的RNA[20]，其中，TRIzol法是用于提取少量組織總RNA的經典方法，但傳統TRIzol法提取總RNA效果較差，RNA易降解，改進TRIzol法能有效提高RNA產率，減少RNA降解，延長RNA儲存時間[12]。

采用改進TRIzol法提取不同發育時期海葵的總RNA，并對其質量進行檢測。結果表明，中晚期海葵總RNA的OD260/280值約為2.0，純度較高，是高質量RNA的標志[17]。采用改進TRIzol法所提取的海葵RNA條帶整齊、清晰，海葵-大與海葵-中的總RNA完整性較好，RIN值分別為8.8和7.3，海葵-大與海葵-中的帶型呈現28S∶18S約為2∶1，說明RNA基本無降解，且完整性好[21]。采用Nano Drop TM 2000分光光度計對總RNA純度(OD260/280)的檢測、Agilent 2100生物分析儀質量檢測與電泳檢測均強有力地支持以上結果。

綜上，采用改進TRIzol法提取不同發育期海葵總RNA的濃度高、純度和完整性較好，改進TRIzol法能有效提取海葵不同發育時期的總RNA，滿足轉錄組測序等分子生物學試驗要求，可為海葵進行高通量轉錄組測序等分子生物學試驗提供基礎，同時也可為海洋動物RNA的提取提供參考。