氣相色譜法測定米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量

李赫宇，王鈺，張東星，於洪建，晏仁義

（天津益倍生物科技集團有限公司，天津300457）

米糠是大米加工過程中的副產物，一般會產生約5%～8%米糠，新鮮米糠中含有米糠油約16%～22%[1]。米糠油中含有3%左右的米糠蠟，米糠蠟中含有高級脂肪烷醇和高級脂肪酸，經實驗室分析，二十八烷醇占總醇的11%～17%；三十烷醇占總醇的17%～22%[2-3]。2017年我國批準米糠脂肪烷醇為新資源食品，規定其工藝為米糠蠟經皂化、提取、過濾等工藝制成。規定主要成分二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇的含量之和為78%～88%。我國大米的產量和加工量占世界總量的三分之一，加工副產物米糠的量也驚人，我國目前在米糠的加工利用方面處在初級階段。米糠脂肪烷醇作為新資源食品使用一定程度上能拉動米糠的綜合利用。

目前米糠脂肪烷醇的標準還不完善，導致目前市場上的對其運用還存在一定的問題。首先，未制定統一的具體的含量測定方法，一般參照GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測定氣相色譜法》測定，或者自擬定的方法，方法的不一致帶來一定的混亂。其次，規定二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇的含量之和為78%～88%。經文獻調研二十八烷醇和三十烷醇的功能作用完全不同。二十八烷醇又名蒙旦醇，發現其能夠治療人體生殖障礙疾病，逐漸被人們所研究[4]。后來大量的研究表明二十八烷醇有抗疲勞，增強身體素質（耐力，精力，體力）[5]、抗凝血作用[6]、降血脂[7-8]、升高人體基礎代謝率[9-11]、提高免疫力[12]、提高反應靈敏度[13]、保護肝臟[14]，細胞保護功能[15]等作用。三十烷醇又名蜂花醇，對植物生長有促進作用，可作為一種新的天然存在的植物生長調節劑[16]。因此，可能會存在脂肪烷醇的含量之和滿足標準，但是比例不同會導致功能的差異。本研究建立氣相色譜內標法，用此來測定市場上不同廠家不同批號的米糠脂肪烷醇樣本，為米糠脂肪烷醇的含量測定方法及標準的提升提供數據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

KQ-250DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；MS105DU型1/10萬電子天平：瑞士梅特勒-托利多有限公司；島津GC-2010 plus氣相色譜儀：日本島津株式會社。

1.2 材料與試劑

米糠脂肪烷醇：市售。

二十八烷醇和三十烷醇對照品（純度99.0%）：中國食品藥品檢定研究院。三苯基苯（純度99.5%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH。色譜純環己烷：天津市康科德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

毛細管色譜柱：HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為N2，流量為0.5 mL/min；分流模式，進樣量為2 μL，分流比 50 ∶1?？諝饬魉伲?00 mL/min；氫氣流速：30 mL/min；進樣口溫度：320℃；檢測器溫度：340℃。柱溫箱溫度程序升溫：初始溫度250℃保持1 min，以5℃/min升溫到290℃，保持15 min，再以8℃/min的速率升到300℃，保持2 min。進樣口溫度：320℃；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID），溫度340℃進行檢測。進樣體積為2 μL，分流比50∶1。

1.3.2 內標液的配置

準確稱取三苯基苯25 mg，置于50 mL容量瓶中，用環己烷溶解并定容至刻度線，配成0.5 mg/mL的內標溶液。置于4℃冰箱貯存備用。

1.3.3 標準工作液的配置

準確稱取二十八烷醇和三十烷醇各50 mg分別置于10 mL容量瓶中，加環己烷溶解并定容，配成濃度為5 mg/mL的標準貯備液。分別準確移取標準貯備溶液0.15、0.35、0.55、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 于 2 mL 容量瓶，分別準確加入0.4 mL內標液，用環己烷定容。配置成 375 μg/mL～3 750 μg/mL 的標準工作溶液。

1.3.4 樣品溶液的制備

精密稱取樣品10 mg～30 mg，置于5 mL容量瓶中，準確加入三苯基苯內標液溶液1.0 mL，60℃加熱溶解，冷卻至室溫（25℃），用環己烷定容，搖勻。

1.4 測定與計算

在所選的色譜條件下，待色譜儀穩定后，將所配置的一系列濃度的標準工作溶液進樣測定。根據內標法的計算公式計算，以Ci/Cs為橫坐標，Ai/As為縱坐標，繪出標準曲線，并求出回歸方程。

式中：f為相對校正因子；Ai為待測溶液中各高級烷醇的峰面積值；As為加入內標物三苯基苯的峰面積值；Ci為待測組分的濃度；Cs為內標物的濃度。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

參照國標GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測定氣相色譜法》中的色譜條件，進行流速、程序升溫與分流比的調整，使方法更適合于米糠烷醇提取物的測試。最終的條件如1.3.1所述。色譜圖基線較參照方法平穩，三苯基苯、二十八烷醇和三十烷醇分離度良好，如圖1所示。GB/T 32947-2016《蜂蠟中二十八烷醇、三十烷醇的測定氣相色譜法》測定米糠脂肪烷醇的色譜圖如圖2所示，基線漂移明顯，二十八烷醇色譜峰前明顯有雜峰未分離開。

2.2 檢測限和定量限

按1.3.1中色譜條件，將1.3.2中標準工作溶液樣品，逐級稀釋不同濃度，當峰高比基線噪音高3倍（即S/N=3）和10倍（即S/N=10）時，以此時物質的濃度為檢測限和定量限。

2.3 標準曲線的繪制

圖1 對照品和米糠脂肪烷醇樣品的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograms of references and sample

圖2 參照GB/T 32947-2016分析樣本的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of sample analyzed by GB/T 32947-2016

按1.3.1中色譜條件，測試1.3.2中標準工作溶液樣品中被測組分與內標物在色譜檢測器上的峰面積。以峰面積之比為縱坐標Y，濃度比為橫坐標X做標準曲線。當峰高比基線噪音高3倍（即S/N=3）和10倍（即S/N=10）時，以此時物質的濃度為檢測限和定量限。結果如表1所示。當內標物質量濃度為100 μg/mL，各標準品在 375 μg/mL～3 750 μg/mL 的濃度范圍內，二十八烷醇和三十烷醇呈現良好的線性關系，R2=0.999 5，說明相關性很高。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品混合溶液，按照1.3.1中色譜條件連續進樣6次，測定峰面積值。記錄峰面積，分別計算二十八烷醇、三十烷醇與內標物三苯基苯峰面積的比值。結果顯示，二十八烷醇與三苯基苯峰面積比值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.80%，三十烷醇與三苯基苯峰面積比值的RSD為1.39%，表明儀器精密度良好。

表1 標準品標準曲線Table 1 Standard curves of references

2.5 重復性試驗

精確稱取一定量的樣品，共6份，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的色譜條件進行分析，測定峰面積，計算含量。結果6份樣品中，二十八烷醇和三十烷醇含量的RSD分別為4.30%和1.67%，表明此方法的重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精確稱取一定量的樣品，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的色譜條件分別于1、2、4、8、12、24 h進樣分析，測定峰面積，計算出樣品中二十八烷醇和三十烷醇的含量。結果顯示，二十八烷醇和三十烷醇含量的RSD分別為3.98%和5.01%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗

分別精密稱取供試品5 mg，共6份。分別加入樣本中基本等量的二十八烷醇和三十烷醇對照品，按照1.3.4中的方法制備供試品溶液，按照1.3.1中的方法進行測定。結果如表2所示。

由表2可以看出，二十八烷醇的回收率為99.41%，RSD為3.28%；三十烷醇的回收率為99.48%，RSD為3.17%，表明本試驗所建立的方法能夠滿足米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量測定。

表2 二十八烷醇和三十烷醇加樣回收率試驗結果Table 2 The results on the recovery rate of octacosanol and triacontanol

2.8 樣品含量測定

按上述的建立的色譜方法，進行樣本的含量測定。每份樣本重復測定兩次，以待測成分與內標物峰面積比，通過回歸方程計算出濃度比，從而計算出試樣中待測成分的量，計算結果如表3所示。

表3 樣品中二十八烷醇和三十烷醇含量Table 3 The contents of octacosanol and triacontanol in samples %

3 討論與結論

本文建立了氣相色譜法，以三苯基苯為內標測定新資源食品米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量，通過分離條件的優化和方法學考察，建立的方法可滿足米糠脂肪烷醇的質量分析要求。分離采用HP-5 色譜柱，在 375 μg/mL～3 750 μg/mL 內均具有良好的線性關系（R2＞0.999）。

15份市場上收集的樣本的分析結果表明有4份樣本的含量不符合我國法規的要求（其中有3份含量略超過88%）。所分析的樣本中三十二烷醇的含量都很低（小于2%），甚至未檢測到。并且二十八烷醇和三十烷醇的對照品易得，而三十二烷醇的對照品難買到。從報道的功能方面考慮，多集中在二十八烷醇的生物活性方面，其他兩個烷醇的生物活性報道很少。隨著純化技術的進步，能夠獲得高純度的二十八烷醇產品，比如樣本1和2中二十八烷醇含量分別高達95.20%和84.36%。并且國外的運用中高純度的二十八烷醇比較受歡迎。因此從實際出發對米糠脂肪烷醇的標準是否可以只測試二十八烷醇和三十烷醇含量，并且規定二十八烷醇需達到某個含量，根據分析檢測的15份樣本可參考制定二十八烷醇達到50%。另外，對于規定3個烷醇含量之和不能超過88%，是否會限制新技術的運用，不能體現優質優價。