反相色譜法檢測利伐沙班片異構體含量

徐開祥 劉志強 任亞東 孫秋艷

（1.揚子江藥業集團有限公司，江蘇 泰州 225321；2.揚子江藥業集團廣州海瑞藥業有限公司，廣東 廣州510663）

利伐沙班(Rivaroxaban)是新型抗凝藥物可以高選擇、直接抑制結合或游離狀態的Xa 因子，進而中斷內、外源性的凝血途徑，抑制凝血酶產生，并最終抑制血栓形成[1]。老年非瓣膜性心房顫動患者采用利伐沙班抗凝治療的有效性及安全性較華法林高，更能有效降低患者的出血事件、不良反應發生率，值得推廣[2]。適應癥為：用于擇期髖關節或膝關節置換手術成年患者，以預防靜脈血栓形成(VTE)。用于治療成人靜脈血栓形成(DVT)，降低急性 DVT 后 DVT 復發和肺栓塞（PE）的風險。用于具有一種或多種危險因素（例如：充血性心力衰竭、高血壓、年齡≥75歲、糖尿病、卒中或短暫性腦缺血發作病史）的非瓣膜性房顫成年患者，以降低卒中和全身性栓塞的風險。本文采用反相色譜法建立了利伐沙班片異構體含量檢測方法。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

利伐沙班對照品，來源于USP，利伐沙班片及空白輔料片，由揚子江藥業集團廣州海瑞藥業有限公司提供；乙腈（色譜純）、水（純化水）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀型號為Agilent 1260，電子天平型號為梅特勒XS250

2 異構體測定方法

2.1 色譜條件

采用高效液相色譜法，以CHIRALPAK IC（4.6*250mm 5μm）為色譜柱，以乙腈為流動相；檢測波長為250nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL∕min。

2.2 樣品配制

系統適用性試驗溶液：取利伐沙班異構體對照品約6mg，精密稱定，置250ml 量瓶中，用稀釋劑（乙腈:水=50:50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為利伐沙班異構體儲備液；另取利伐沙班對照品約15mg，精密稱定，置10ml 量瓶中，精密加入利伐沙班異構體儲備液1ml，用稀釋劑溶解并稀釋制成每1ml 中約含利伐沙班異構體2.4μg、利伐沙班1.5mg 的混合溶液，作為系統適用性溶液。

供試品溶液：取本品細粉約640mg（約相當于利伐沙班75mg），精密稱定，置50ml量瓶中，加稀釋劑適量，超聲30min使溶解并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml 中約含利伐沙班1.5mg的供試品溶液。

對照溶液：精密量取供試品溶液5ml，置100ml 量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液；精密量取對照儲備液3ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

圖1 空白輔料色譜圖

圖2 利伐沙班異構體色譜圖

靈敏度溶液：精密量取對照儲備液1ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液

2.3 異構體測定

系統適用性溶液中，利伐沙班異構體和利伐沙班的分離度應不小于1.5；靈敏度溶液中，主峰的信噪比應不小于10。

樣品測定：進樣體積為20μL，按自身對照法計算本品異構體含量。

3 方法學研究

3.1 專屬性試驗

稱取空白輔料粉末約640mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加稀釋劑適量，超聲30min 使溶解并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。以稀釋劑[乙腈:水=50:50]為空白溶劑；分別采集空白溶劑、空白輔料溶液、供試品溶液、對照溶液的圖譜。圖譜見下圖1～圖3，空白輔料溶液在供試品、對照品溶液的主峰位置無干擾峰，即輔料對異構體測定無干擾。

3.2 檢測限和定量限

取對照品溶液，稀釋后進樣，信噪比為10:1時為定量限，信噪比為3:1 時為檢測限，檢測限濃度為0.10201μg∕ml，檢測量為2.04ng，約相當于供試品濃度0.007%；定量限濃度為0.34004g∕ml，約相當于供試品濃度0.023%

3.3 線性與范圍

取利伐沙班異構體對照品，配制成濃度分別為0.34μg∕mL、1.13μg∕mL、1.81μg∕mL、2.27μg∕mL、3.40μg∕mL、4.53μg∕mL 的利伐沙班異構體溶液，進樣，收集峰面積數據，結果見表1。

表1 線性結果

圖3 利伐沙班色譜圖

以利伐沙班異構體濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行擬合，結果顯示，利伐沙班異構體在0.34μg∕ml～4.53μg∕ml 的濃度范圍內，與峰面積的響應值線性相關，線性方程為y=71.2240x-0.6779，相關系數為r=0.99998。

3.4 準確度

按50%、100%、120%三個濃度水平，稱取利伐沙班異構體加入到供試品溶液中，配置方法同供試品溶液配制方法，采用本方法進行檢測，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 準確度測定結果

結果顯示，在50%、100%、120%三個濃度水平下，平均回收率為101.2%，RSD 為0.6%（n=9），結果符合要求，說明方法具有良好的準確度。

3.5 重復性

取同一批次，配置6份樣品，分別進樣檢測，結果顯示，6份樣品的測定結果均在0.032%～0.035%之間，RSD為3.2%（n=6），異構體測定方法的重復性較好。

3.6 溶液穩定性

取供試品溶液 1 份，分別于配樣后 4h、8h、12h、16h、20h、24h進樣，統計異構體含量，結果見表3。結果顯示，樣品溶液在24h內穩定。

表3 溶液穩定性測定結果

3.7 耐用性試驗

取系統適用性試驗溶液、靈敏度溶液、對照溶液和供試品溶液，對色譜條件中的波長、流速、柱溫進行變動，從分離度、靈敏度信噪比、異構體含量結果各方面來考察該方法的耐用性，結果見表6。

表4 耐用性試驗結果

從表格數據可以看出，改變波長、流速、柱溫，系統適用性均符合要求，對異構體檢測結果影響不大，該方法耐用性良好。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

利伐沙班的最大吸收波長為250nm，故選擇250nm 作為利伐沙班的檢測波長。

4.2 溶劑的選擇

崔萍等[3]建立了異構體檢測方法，使用研創IB 手性柱，流動相為正己烷(含0.1%三氟乙酸):異丙醇:乙醇(60∶20∶20)；張倩如等[4]也建立了異構體檢測方法，方法為色譜柱為Chiralpak IA(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為100%甲醇，流速為1.0ml∕min，檢測波長為250nm，柱溫為40℃。上述方法均針對本品種原料藥建立檢測方法，使用均為正相色譜法，正相色譜法存在液相切換復雜，靈敏度較低。本品制劑中存在大量的輔料，輔料在有機溶劑存在溶解性問題，需要水參與來溶解片劑輔料，但正相系統不能兼容水，可能會損壞正相色譜柱。因此在方法建立上，建立了反相色譜法來兼容

5 結語

本方法測定結果準確，精密度高，耐用性良好，可以作為利伐沙班片中異構體含量測定方法。