高效液相色譜法測定注射用左亞葉酸鈉的有關物質

朱麗娟

摘? ?要：為了研究注射用左亞葉酸鈉中的相關物質，文章使用色譜檢驗法，檢測出左亞葉酸鈉的定量限為2.0 ng，檢測限為0.6 ng?？梢?，高效液相色譜法可用于測定注射用左亞葉酸鈉的有關物質。

關鍵詞：左亞葉酸鈉;高效液相色譜法;有關物質

色譜檢測法指的是將不同的細菌混合物在特定的環境中進行相互溶解、解析、吸附、脫附，在以上的環境中進行多次的操作之后能夠得到物質的分離現象，并且隨之使用不同的檢測形式進行細菌內部的檢驗，能夠將細菌甄別到屬、種甚至株，能夠保證較高的分辨率和較為準確的檢驗結果，并且分析的速度較快，能夠在檢驗的過程中分析出較為穩定的指標。在分析中不會受到細菌年齡、生長條件等客觀因素的影響，對于細菌的鑒別具有十分重要的作用。

1? ? 實驗方法

材料準備需要注射用左亞葉酸鈉放置于飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37 ℃。

1.1? 專屬性實驗

（1）96孔板接種細胞：PC-3和RWPE-1，HCT-116接種質量濃度為5 000個/孔、2 000個/孔。每9個實驗組為96孔板，每一個孔板上有6個復孔。其中，培養要求是0.25%胰酶-EDTA能夠在常規環境中完全消化，并且成為單個細胞懸液。培養的要求為在CO2的飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37 ℃，培養時間為24 h。

刺激細胞：對于左亞葉酸鈉干預細胞的刺激強度為0～8.4 mmol/L依次遞增的情況，進而能夠看出不同刺激強度的背景下，干預細胞自身出現的情況和變化，保證實驗效果的科學性和真實性。培養的要求為在CO2的飽和濕度敷箱培養，培養溫度為37 ℃，培養時間為72 h。

（3）呈色：在上述步驟進行之后，在培養容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔劑量），并且保證培養環境的穩定和正常，此次的培養時間為3 h左右。在此基礎上，將上清液吸走，并且在培養孔中添加150 μL DMSO。值得注意的是，添加此類試劑之后，液體中極易出現沉淀物，需要將試管輕輕晃動，保證添加劑能夠充分溶解。

1.2? 溶液穩定性試驗—SDS-PAGE凝膠電泳

灌分離膠：TEMED加入的計量與分子量的不同配置不同濃度之間具有密切的關系。在灌膠的過程中應當保證灌膠的速度，在灌膠高度在容器總高度的1/3左右，即5.5 cm左右的情況下就代表灌膠結束。此時，可以使用雙蒸水緩慢封閉容器。由于這一系列的操作關系著實驗的穩定性和準確性，在進行操作的過程中應當采用輕柔緩慢的操作手法，避免對人工環節造成影響。在整體的操作結束之后，將實驗設備靜置30 min左右，隨后觀察情況。

灌濃縮膠：30 min自由凝固結束之后，觀察到容器中水和膠水之間中存在一條明顯的折線就能夠證明膠水已經凝固。當膠水凝固之后則可以進行下一步實驗工作，添加一部分水在容器上方，多余的水分需要使用紙巾擦拭干凈。與此同時，將配置好的試劑快速加入其中，在添加之后保證設備能夠平穩靜置，保證靜置時間在30 min以上。24 h之后，將膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋。非磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋。將膜放入加了二抗的二抗稀釋液中，室溫慢搖3 h。孵育完畢后用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。

1.3? 含量測定

1.3.1? 細胞準備

對于PC-3細胞，0.25%胰酶-EDTA進行常規消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5 000個/孔、2 000個/孔。每9個實驗組為96孔板，每一個孔板上有6個復孔。在相同的環境背景下，4.8 mmol/L，7.2 mmol/L的左亞葉酸鈉對于p-mTOR的表達都具有明顯的影響作用，并且應用在p-p70S6k，p-S6，p-4E和p-4E-BP1的表達的影響上效果相同。

1.3.2? 蛋白樣品的制備

（1）保證培養時間超過24 h，對細胞進行沖洗，沖洗使用的試劑是4 ℃預冷的PBS。每瓶細胞將PBS盡量吸取干凈，而后加入200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液槍緩慢將細胞碎片吹打至瓶底一角（稱為裂解蛋白液），在裂解蛋白液的過程中應當保證不要有氣泡。將裂解之后的試劑放在冰上靜置10 min左右，與此同時將離心機進行4 ℃預冷。

（3）將裂解蛋白液移至EP管內，12 000 r，30 min，同時打開紫外分光光度儀進行初始化。

（4）取3×10 μL共3管，用不含蛋白酶抑制劑的RIPA洗3次，在上述步驟進行之后，在培養容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔劑量），并且保證培養環境的穩定和正常，此次的培養時間為3 h左右。在此基礎上，將上清液吸走，并且在培養孔中添加150 μL DMSO。需要將培養皿放在搖床上輕輕搖動，保證其中的試劑能夠充分溶解。

2? ? 實驗結果

色譜檢驗在實行的過程中具有極強的敏感性和特異性，在進行病原體和微生物檢驗檢測的過程中，能夠呈現出自身的優勢，對于微生物的檢驗過程中對于微生物樣本的質量要求較低，即便是檢測樣本中存在大量死亡微生物，也能夠保證檢驗的有效性和準確性。一旦檢測樣本中有兩種或者是兩種以上的微生物，傳統意義上的檢驗進程需要進行微生物的提純，進而保證檢驗的真實性，而色譜檢驗則可以在樣本成分復雜的情況下進行檢驗，并且提供準確的檢驗效果。本品分別在酸、堿、氧化、光照、高濕及高溫條件中進行強制破壞，各降解產物均能檢出，且與主成分峰能達到良好分離。

3? ? 結語

左亞葉酸鈉在世界范圍內的臨床診療中具有廣泛并且良好的使用效果，由于在治療的過程中副作用較小，成為醫生們高頻使用的藥物。近年來，左亞葉酸鈉逐漸被發現在治療腫瘤的治療中具有良好的效果，但是其中存在的安全隱患和局限性仍舊未能得到良好的整合和研究。在診療過程中使用抗雄激素療法能夠取得相應的治療成效，然而患者在接受診療的過程中經常出現對激素治療的抵抗現象，進而影響了前列腺治療的穩定性和有效性。長時間內對于治療前列腺的方式方法均沒有穩定的界定和實施，逐漸成為前列腺疾病治療的關鍵性難題。

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