液相色譜-串聯質譜法測定牛排產品中大豆蛋白含量

李瑩瑩，張穎穎，任 南，李石磊，趙文濤，田寒友，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

牛排起源于西方國家，是歷史悠久的西式菜肴。近年來我國人民生活水平提高，牛排產品市場快速增長，據行業統計，目前規模以上牛排生產企業已達200余家，牛排的產量也快速增長。目前市售的預包裝牛排以牛肉為主料，同時添加淀粉、大豆蛋白等改善牛肉風味。不同工藝的牛排價格差異顯著，等級也不同，目前牛排等級劃分主要依據蛋白含量。大豆蛋白成本低，加入一定量的大豆蛋白，可以提高蛋白含量，但有些商販雖然加入了大豆蛋白，但在標簽上卻未作標注或標注不實，也屬于一種欺詐行為。目前缺少大豆蛋白定量的準確方法，在牛排定級上也存在一定的困難，因此，有必要建立適用于牛排產品中大豆蛋白含量測定的方法。

傳統的蛋白分析方法主要為凱式定氮法。在待測對象中，當大豆蛋白和其他動物蛋白或者植物蛋白成分混合在一起時，需要對不同蛋白成分進行區分[1]。岳巧云等[2]采用實時聚合酶鏈式以應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）法，以大豆內源基因為參照基因，按比例混合奶粉和含大豆蛋白的配方營養粉進行測定，可以判斷奶粉中是否摻入了豆粉。許任偉[3]設計了大豆蛋白的特異性引物和探針，構建了real-time PCR鑒別牛肉制品摻假大豆方法。但PCR技術也存在一定問題，如DNA易受復雜基質干擾[4]、加工過程易降解[5]等。以特異的肽段作為生物標志物的質譜技術[6-7]在物種定性定量分析展現了強大的技術優越性。該技術以特征肽段為研究對象，肽段的基礎氨基酸序列在加工過程中比DNA更為穩定，使其在深加工制品的處理和定量測定方面具有不可比擬的優勢[8-9]。質譜多重以應監測（multiple reaction monitoring，MRM）是針對靶標分子的一種質譜分析技術，注重有限目標的蛋白質定量測定，在蛋白質分析檢測應用領域極有發展潛力[10]。國外實驗室目前主要針對熟肉制品，包括豬[11]、牛[12]、雞[13]、馬[14]、火雞[15]等不同的動物物種開展研究工作，而植物蛋白相對研究較少。其中，Josephine等[16]對3 種不同的小麥開展了特異性多肽的篩選，并構建液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的鑒別方法，可以實現1%添加的鑒別。Alexander等[17]使用Nano LC-MS/MS和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大豆蛋白進行篩選，最終選擇大豆球蛋白G4亞基A4作為鑒定的標記蛋白。Hoffmann等[18]構建高效液相色譜-串聯質譜區分肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆成分的方法，并利用同位素內標法測定其多肽和所屬蛋白的含量。該研究領域由于蛋白類型繁多，涉及蛋白家族，各種亞基，以及不同多肽質譜響應差異顯著，開展定量分析難度比較大[19]，研究較少。目前，采用同位素內標法對肉制品中過敏蛋白進行定量測定[20]，以及非標記定量方法定量肉制品中的成分[21]，但鮮見大豆蛋白定量分析相關研究報告。

本研究采用高靈敏度、高掃描速度的高分辨質譜系統鑒定大豆蛋白，通過比較和分析尋找其特異性多肽，通過Unitprot數據庫進一步篩查確認，以及LC-MS/MS系統驗證，篩選大豆蛋白特異性強、穩定性好的多肽，并確證可用于定量分析的多肽，擬建立一套用于大豆蛋白定性定量分析的LC-MS/MS方法，以期實現對于牛排產品中大豆蛋白含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛排 市購；大豆分離蛋白（1#）、豌豆蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、小麥蛋白 北京美添前景科技有限公司；大豆分離蛋白（2#、3#）、大豆濃縮蛋白（4#、5#） 山東萬得福實業集團有限公司；生鮮牛肉來自屠宰場。

胰蛋白酶（測序級）、二硫蘇糖醇（生化級）美國Promega公司；碘乙酰胺、三氟乙酸（均為生化級） 美國Sigma公司；甲酸、乙酸、乙腈（均為色譜純） 德國CNW科技公司；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國Waters公司；尿素、硫脲、鹽酸、碳酸氫銨均為國產分析純。

牛肉-大豆蛋白的混合體系：參照牛排通用的生產工藝[22]，構建牛肉-大豆蛋白的混合體系，大豆蛋白含量根據實驗內容適當調整，其他成分按照牛肉（10 g）、水（3.5 g）、淀粉（0.15 g）、三聚磷酸鹽（0.04 g）、鹽（0.2 g）比例混合備用。

1.2 儀器與設備

Vanquish UPLC-Q Exactive HF-X液相色譜-高分辨質譜（配有電噴霧離子源及TraceFinder 4.1數據處理系統以及Proteome Discoverer2.8軟件）、TSQ ultra EMR LC-MS聯用儀（配有電噴霧離子源、TraceFinder 4.1數據處理系統） 美國Thermo Fisher公司；ZWY-110X30往返式水浴恒溫搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司；JXFSTPRP-II液氮冷凍研磨儀 上海凈信發展有限公司；20PR-520離心機 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取0.5 g樣品（精確至0.001 g），放置5 mL離心管中，加入2.5 mL緩沖鹽提取液（pH 8.0，0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液、2 mol/L硫脲溶液），打開液氮，冷凍研磨（60 Hz，45 s）2 次后，15 000 r/min離心15 min。

取100 μL上清液，放置5 mL離心管，加入50 mmol/L二硫蘇糖醇溶液30 μL，56 ℃振蕩以應1 h，降至室溫后加入100 mmol/L碘乙酰胺溶液33 μL，暗處以應30 min；向上述以應體系中加入50 mmol/L NH4HCO3100 μL，然后加入20 μg胰蛋白酶，37 ℃以應過夜。放置室溫后，加入0.4%三氟乙酸溶液終止以應，準備上樣。依次用3 mL乙腈、50%乙腈溶液、0.5%乙酸溶液活化HLB固相萃取柱，全部溶液上樣，再依次用3 mL水，0.5%乙酸溶液淋洗，最后用2 mL乙腈-0.5%乙酸（6∶4，V/V）洗脫，過0.22 μm濾膜，待測[23]。

1.3.2 液相色譜-高分辨質譜分析

LC條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：A為0.1%甲酸-水，B相為0.1%甲酸-乙腈；洗脫程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～40% B；10～16 min，40%～80% B；16～18 min，80%～5% B；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

MS條件：噴霧電壓3.4 kV；毛細管溫度320 ℃；離子源霧化溫度350 ℃；鞘氣壓力40 arb；輔氣壓力15 arb；離子化模式：正模式；掃描模式：Full MS-dd-MS2；全掃描分辨率120 000 FWHM；質量掃描范圍m/z 350～1 500；自動增益值為3×106，最大離子注入時間20 ms，二級質譜掃描分辨率為15 000 FWHM，topN為20（前20強），自動增益值為1×105，最大離子注入時間為100 ms，碰撞能量為27 V[24]。

數據分析：用蛋白質組學處理軟件Proteome Discoverer（PD 2.8）對高分辨質譜采集的數據進行非標記定量分析，檢索數據庫為Uniprot對應物種的數據全庫，搜索流程按圖1進行，最多漏切位點設為2，每個多肽最大平均修飾為3，母離子質量偏差為10×10-6，多肽最小長度為6，其他參數為默認值。

圖1 PD軟件分析流程圖Fig. 1 Workflow of PD analysis

1.3.3 LC-MS/MS分析

LC條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸-水，B相為0.1%甲酸-乙腈；洗脫程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～40% B；10～16 min，40%～80% B；16～18 min，80%～5% B；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

MS條件：噴霧電壓3 000 V；離子源霧化溫度350 ℃；離子傳輸管溫度300 ℃；鞘氣壓力45 arb；輔氣壓力15 arb；碰撞氣壓強1.5 mTorr；離子化模式：正模式；采集方式：MRM。

數據分析：通過PD軟件找出大豆物種的專屬性多肽鏈，將多肽序列列表導入到skyline軟件，獲得每個多肽鏈的母離子和子離子碎片信息，并將離子信息導入LCMS/MS中，開展MRM掃描，通過對比每組離子對的保留時間、響應強度等信息，對特異性離子對進行篩查，以確定定性離子信息。

1.3.4 標準曲線的制作

稱取0.1 g（精確至0.000 1g）大豆分離蛋白（1#）按照1.3.1節前處理方法，第1步離心后，分別取20、50、100、150、200 μL，質量濃度以大豆蛋白質量計，對應的質量分別為0.020 0、0.050 0、0.100、0.150、0.200 g，進行后續的實驗操作，待測溶液進LC-MS/MS分析。以大豆蛋白的質量作橫坐標，篩選的大豆蛋白多肽峰面積作縱坐標，計算回歸方程。

1.3.5 檢測結果計算

待測樣品的稱樣量（g）為m，將待測樣品各個多肽的峰面積代入對應大豆蛋白多肽的回歸方程，得到相應大豆蛋白的質量（g）為mi，待測樣品中大豆蛋白質量分數X按下式計算：

2 結果與分析

2.1 前處理的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

不同提取溶劑提取出的蛋白種類和數量不同，需優化提取溶劑以最大化地提取蛋白。3 種常見蛋白的提取溶劑分別為0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、緩沖溶液2（0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液）、緩沖溶液3（0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素溶液、2 mol/L硫脲溶液）。考察3 種溶劑對大豆蛋白中大豆專屬多肽的提取效果，由圖2可知，緩沖液2、3能夠將大豆蛋白的12 條多肽全部提取出來，而緩沖液1對多肽3、4、6、7、11等提取效率比較低。對比緩沖液2、3可以發現，緩沖液3提取的多肽響應值大部分都高于緩沖液2，因此，Tris-HCl+尿素+硫脲組合的提取溶劑為最佳選擇。

高濃度的尿素能有效地使蛋白質變性，尤其破壞非共價鍵結合的蛋白質，可以提高蛋白質的可溶性[25]；而加入硫脲，兩者聯合發揮協同作用，更增強了溶解疏水蛋白質的能力[26-27]；此外，蛋白質變性后，打開多肽鏈成為無規構象，也便于后續溶劑接近基團進行以應。蛋白提取是在液氮條件下進行高速振蕩，既破壞組織細胞，釋放蛋白，又可盡量減少細胞內的酶解以應[28]。

圖2 不同提取溶劑對多肽的提取對比Fig. 2 Comparative analysis of peptide extraction with different extraction solvents

2.1.2 酶解條件

傳統胰蛋白酶解時間一般為12～16 h（過夜），酶解時間過長影響實驗效率，酶解時間不足導致獲得多肽不充分[29]。考慮到待測樣品中既有動物蛋白也有植物蛋白，蛋白含量較高，酶解后得到的多肽濃度需足夠，同時考慮到酶解后多肽的重復性對于定量分析很重要，因此有必要考察酶解時間和多肽含量的關系。分別考察酶解2、4、6、8 h及過夜（16 h）的條件下，目標多肽的測定情況，結果顯示，不同酶解時間均能檢測到目標多肽，但各多肽的含量有一定差異。短時間酶解后多肽的重復性比長時間酶解的重復性差，過夜酶解的重復性最好。因此為了確保酶解充分，選擇過夜酶解。

2.2 大豆蛋白定性多肽的篩選

特異多肽的篩選是構建質譜方法的關鍵所在，也是構建大豆蛋白定性方法的前提。常用的植物蛋白主要包括大豆蛋白（1#～5#）、豌豆蛋白、玉米蛋白、花生蛋白和小麥蛋白，利用高分辨質譜準確的定性鑒別能力，將這些常見的植物蛋白按照1.3.1節前處理方法進行處理，每個樣品平行3 次，按照1.3.2節檢測條件進行上機分析。將得到的高分辨質譜掃描數據導入PD2.8軟件，針對Unitprot對應物種蛋白搜庫，可尋找到大豆蛋白特有的多肽列表，將多肽信息導入LC-MS/MS進行分析，確認母離子、子離子信息，構建MRM分析方法，并進一步開展多肽的驗證。

大豆蛋白含量豐富，數據庫資源也比其他植物蛋白信息充分，篩選到的多肽達3 000多條。通過PD軟件分析，并搜索Unitprot數據庫確認，發現大約6%多肽是大豆特異性多肽。將這些多肽序列導入到skyline軟件，可轉化成離子對信息，再將離子對信息導入到LC-MS/MS，參照1.3.3節方法分析。

MRM是針對靶標分子的一種質譜分析技術，該技術采用三重四極桿質譜儀，檢測靶標分子的母離子和子離子的質譜響應信號，從而獲取較靈敏和高重復性的定性和定量信息，具有靈敏、準確和特異等特點[30]。各個多肽的氨基酸組成不同，序列長度、等電點不同，導致在LC-MS/MS上的保留時間、離子化和質譜響應等都有明顯差異，因此需要開展適用于LC-MS/MS上特異性多肽的挑選，需要滿足以下條件[31]：每個多肽母離子下子離子不少于3 個；母離子和子離子響應較高。按照此條件，共挑選出大豆定性多肽12 個，多肽信息見表1。以挑選出的多肽ESYFVDAQPK為例，相對分子質量為1 183.28，帶2 個正電荷，母離子m/z592.3，挑選出4 個子離子，分別為m/z558.3、244.2、657.4、804.4，見圖3A～D。

表1 篩選出的大豆定性多肽列表Table 1 List of peptides selected for qualitative analysis of soybean protein

圖3 ESYFVDAQPK多肽提取離子流圖Fig. 3 Extracted ion current chromatogram of peptide ESYFVDAQPK

2.3 大豆蛋白定量多肽的篩選

肉制品中添加的大豆蛋白越多，大豆蛋白含量越高，意味著大豆多肽含量越高。但考慮到多肽種類繁多，酶解過程復雜，影響因素較多，并不是所有特異性多肽的含量與蛋白含量呈正相關，因此需要開展定量多肽的篩選。定量多肽需要具備兩大特征，第1是可以構建較好的線性關系（相關系數不應低于0.99），第2是能夠滿足方法構建需要的回收率。

2.3.1 標準曲線

目前沒有大豆蛋白定性定量的標準物質，選擇肉制品加工常用的大豆分離蛋白（純度在92%以上）作為標準物質，稱取0.100 9 g大豆分離蛋白1#按照1.3.4節方法，以大豆蛋白的質量作橫坐標，表1篩選的12 條多肽的峰面積作縱坐標，分別構建相應的線性曲線，排除線性關系系數小于0.99的多肽，見表2。以大豆多肽LITLAIPVNKPGR為例，以大豆蛋白質量計分別為0.020 1、0.050 2、0.101、0.151、0.201 g，峰面積分別為359 551、946 798、1 879 419、2 904 559、3 811 630，其構建的線性方程為y=1.906×107x-2.485×104。篩選的8 條多肽主要來源于pyruvate kinase、α-subunit ofβ-conglycinin、glycinin、kunitz trypsin inhibitor、3S albumin、2S albumin大豆的主要蛋白。其中α-subunit ofβ-conglycinin、glycinin、3S albumin、2S albumin蛋白與Alexander等[17]篩選的大豆蛋白的結果相符。

表2 線性關系系數大于0.99的多肽列表Table 2 List of peptides with linearity correlation coefficients greater than 0.99

2.3.2 回收率結果

參照混合不同含量的大豆蛋白，將混合后的樣品按照前處理方法，選擇表3中的8 條多肽進行LC-MS/MS測定，采用標準曲線定量計算加標回收率。

表1中的8 個多肽，部分多肽回收率太高，超過140%，有些回收率太低，低于60%，soy1#、soy2#、soy5#多肽計算的回收率為81.7%～115.8%，精密度小于13%，見表3，證明該3 個多肽用作定量具有較高的準確度和穩定性，使用該方法能夠較可靠地測定牛排樣品中大豆蛋白含量。

表3 3 個定量多肽的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision of the three peptides

綜合以上結果，最終確認用于大豆蛋白定量的多肽為GSDLVNVR、VSDDEFNNYK、LVFCPQQAEDDK。

2.3.3 LC-MS/MS方法檢出限結果

為了測定方法的靈敏度，將大豆蛋白按質量分數0.15%添加到牛肉-大豆蛋白混合體系，進行樣品處理及數據分析，結果顯示大豆蛋白用于定量的3 條多肽均有檢出，以3 倍和10 倍信噪比確定方法的檢出限和定量限，最終確定大豆蛋白3 條定量多肽的檢出限為0.15%，定量限為0.5%。

2.4 真實性樣品的測定

表4 市售牛排中大豆蛋白含量測定結果Table 4 Determination of soybean protein content in commercial steak based on the three peptides

續表4

為了進一步驗證該方法的適用性，市購牛排28 件并進行檢測，見表4。結果顯示，絕大多數市售牛排都做了合理標示，大豆蛋白檢測結果也在合理范圍。但7、8、9、14、18號牛排的配料表中僅標識了牛肉，但實際測定出大豆特異性多肽，證明確實加入了大豆蛋白，尤其14號沙郎牛排，大豆蛋白含量超過2%。

3 結 論

本研究針對牛排產品構建基于LC-MS/MS對大豆蛋白準確定性及定量的分析方法，共篩選出大豆蛋白的特征定量多肽3 條，并經過方法學驗證，檢出限為0.15%，定量限為0.5%，平均加標回收率為81.7%～115.8%，精密度小于13%。采用本方法準確度高、干擾少，具有較高的靈敏度和回收率。建議研制相應大豆蛋白的標準物質，用于定性及定量分析，可拓展該方法的廣泛應用，基于此原理可同時進行其他肉類食品的大豆蛋白含量及其他植物蛋白的鑒別。該研究為摻假檢測提供了思路，可以同其他技術相互補充，在食品真偽鑒別領域具有廣闊的市場應用前景。