利舒康膠囊對模擬高原缺氧大鼠肺組織損傷的保護作用

孟盼盼，郭建魁，王 榮，崔冰冰，景臨林，馬慧萍

高原低壓性缺氧環境除了對人體的各組織器官系統功能、代謝等產生影響外，還會引起以缺氧為突出表現的特殊類型疾病即急性高原病[1]。當人們急進高原時，隨著海拔的上升，呼吸系統首先受到缺氧的影響，肺泡上皮和毛細血管內皮細胞的各種直接和間接損傷引起機體肺損傷，最嚴重的急性肺損傷形式是呼吸窘迫綜合征，這是急性肺損傷危重患者發病率和病死率高的主要原因，也是引起高原肺水腫的直接原因[2-4]。但現有藥物還不能滿足有效預防和治療高原缺氧的需求，尋找有效的高原抗缺氧藥物具有重要意義。

藏藥利舒康膠囊是國家最早批準臨床使用的傳統中藥復方制劑，具有明顯的緩解高原反應、高原紅細胞增多癥、高原腦水腫、高原心臟病等作用[5]。課題組前期研究表明，利舒康膠囊對高原缺氧大鼠心、腦組織具有明顯的保護作用[6-7]，但在對肺組織保護作用方面的研究還尚未見報道。本研究擬通過模擬高原海拔8000 m缺氧12 h觀察利舒康膠囊對缺氧大鼠肺損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠(體重180～220 g)，購自蘭州大學，實驗動物合格證號SCXK(甘)2013-0002，飼養于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗科。

1.2實驗儀器 FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業貴州風雷航空軍械有限責任公司)；BP210S電子天平(荷蘭賽多利斯有限公司)。

1.3藥品與試劑 利舒康膠囊(青海益欣藥業有限責任公司，批號：20161207)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(批號：20161220)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號:20161209)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20161220)、乳酸(LD)試劑盒(批號：20170106)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：20161219)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號：20161219)、過氧化氫(H2O2)試劑盒(批號：20161219)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號：20161220)、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒(批號：20170106)均購于南京建成生物工程研究所。

1.4模擬海拔8000 m高原急性缺氧實驗 取SPF級健康雄性Wistar大鼠72只，適應飼養3 d后隨機分為常氧對照組、缺氧模型組、紅景天膠囊組、利舒康膠囊低、中、高劑量組，每組12只。常氧對照組和缺氧模型組灌服等體積注射用水，紅景天膠囊組灌服紅景天膠囊280 mg/kg，利舒康膠囊低、中、高劑量組分別灌服280、420、560 mg/kg利舒康膠囊，灌胃給藥7 d。第7天給藥50 min后將動物放入低壓低氧動物實驗艙模擬海拔8000 m缺氧環境，以10 m/s的速度減壓上升至8000 m海拔，維持缺氧12 h，完成減壓缺氧后在海拔3500 m處將大鼠處死，并對肺組織進行相應處理。常氧對照組大鼠不缺氧。

1.5觀察指標

1.5.1病理組織檢測：各組隨機取2只大鼠肺組織標本，置10%甲醛中固定，樣品送往中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院病理科，進行石蠟包埋、組織切片、HE染色以及光鏡觀察。

1.5.2生化指標檢測：各組取10只大鼠的肺組織標本，稱重后加入9倍體積的生理鹽水，使用組織勻漿器在冰水浴中勻漿，部分勻漿在4℃離心機內1500 r/min離心10 min，吸取上清液-80℃凍存，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶測定備用；其余勻漿在4℃離心機內3500 r/min離心10 min，吸取上清液-80℃凍存，用于GSH-PX、GSH、NOS、MDA、LD、LDH、H2O2指標測定。測定方法嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1肺組織顯微結構 常氧對照組肺內支氣管為單層纖毛柱狀上皮結構、肺泡腔呈空泡狀薄壁結構；缺氧模型組炎性細胞浸潤支氣管平滑肌層，肺泡壁增厚，肺泡腔縮小；紅景天膠囊組肺泡壁可見明顯水腫，肺泡腔縮小；利舒康膠囊低劑量組炎性細胞浸潤支氣管平滑肌層，部分肺泡壁增厚，肺泡腔縮小；利舒康膠囊中劑量組部分肺泡壁可見水腫；利舒康膠囊高劑量組大部分肺泡形態較好，少部分肺泡壁增厚。見圖1。

2.2肺組織氧化應激相關生化指標 與常氧對照組比較，缺氧模型組大鼠肺組織MDA、H2O2含量和NOS活力均顯著升高，GSH含量和GSH-PX、CAT活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)。紅景天膠囊組MDA、H2O2含量、GSH-PX、CAT活力與缺氧模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，NOS活力低于缺氧模型組，GSH含量高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。利舒康膠囊中劑量組CAT活力高于缺氧模型組，利舒康膠囊高劑量組MDA、H2O2含量和NOS活力低于缺氧模型組，GSH含量和GSH-PX、CAT活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

圖1 模擬高原缺氧大鼠肺組織顯微結構的變化(HE×400)

A.常氧對照組;B.缺氧模型組;C.紅景天膠囊組;D.利舒康膠囊低劑量組;E.利舒康膠囊中劑量組;F.利舒康膠囊高劑量組

表1 6組大鼠氧化應激指標水平比較

注：紅景天膠囊組給予紅景天膠囊280 mg/kg灌胃，利舒康低、中、高劑量組分別給予利舒康膠囊280、420、560 mg/kg灌胃；MDA為丙二醛，H2O2為過氧化氫，GSH為谷胱甘肽，CAT為過氧化氫酶，NOS為一氧化氮合酶，GSH-PX為谷胱甘肽過氧化物酶；與常氧對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與缺氧模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3肺組織能量代謝相關生化指標 與常氧對照組相比，缺氧模型組大鼠肺組織LD、LDH含量顯著增加，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)。紅景天膠囊組LD含量與缺氧模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，LDH活力低于缺氧模型組，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。利舒康膠囊高劑量組LD、LDH含量低于缺氧模型組，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 6組大鼠肺組織LD、LDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶比較

注：紅景天膠囊組給予紅景天膠囊280 mg/kg灌胃，利舒康膠囊低、中、高劑量組分別給予利舒康膠囊280、420、560 mg/kg灌胃； LD為乳酸，LDH為乳酸脫氫酶；與常氧對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與缺氧模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

近年來，隨著高原經濟的發展和旅游業的日益興旺，越來越多的人需要進入高海拔地區，從而引發急性高原病，如果救治不及時病死率很高[8-10]。肺組織對缺氧環境的感知較為敏感，機體在缺氧環境中氧自由基代謝失衡，導致肺毛細血管內皮細胞損傷，肺血管通透性增加，加重肺組織損傷，從而引發高原肺水腫[11-13]。組織病理學結果顯示，模擬海拔8000 m高原缺氧環境12 h后，缺氧模型組大鼠肺組織炎性細胞浸潤支氣管平滑肌層，肺泡壁增厚，肺泡腔縮小；紅景天膠囊組肺泡壁可見明顯水腫，肺泡腔縮小；利舒康膠囊高劑量組大部分肺泡形態較好，少部分肺泡壁增厚。提示利舒康膠囊可明顯改善模擬高原缺氧大鼠肺組織的損傷。

在模擬海拔8000 m高原缺氧環境12 h后，機體會發生一定的氧自由基代謝紊亂，MDA含量顯著升高，MDA可反映機體自由基的代謝情況，間接地反映出機體器官的損傷程度[14]。NOS可誘導NO的生成，而NO 的過量增多導致了機體的脂質過氧化，并誘導DNA損傷[15]。本研究結果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織MDA含量和NOS活力升高，提示大鼠在模擬低壓低氧條件下，機體的氧自由基代謝確實會出現紊亂，抗氧化系統被破壞，活性氧自由基在機體內大量堆積，導致機體肺組織損傷，而高劑量利舒康膠囊給藥后，MDA含量和NOS活力均出現顯著降低。

H2O2主要是在機體新陳代謝中物質氧化分解過程中產生的，檢測這一指標，可以反映出缺氧條件下機體受損傷的程度。而機體內過量的H2O2主要靠CAT清除，CAT是機體主要的活性氧清除酶[16]。GSH-PX是機體內廣泛存在的一種過氧化物分解酶，GSH是GSH-PX的底物，是GSH-PX完成其功能的基礎。GSH和GSH-PX的作用都是減少自由基的產生，防止脂質過氧化及其代謝產物對機體造成的損傷[17]。本研究結果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織H2O2含量較常氧對照組顯著升高，而高劑量利舒康膠囊給藥后明顯降低；缺氧模型組CAT活力較常氧對照組顯著降低，利舒康膠囊給藥后隨劑量的增大逐漸升高，中、高劑量組與缺氧模型組比較差異均有統計學意義；缺氧模型組GSH含量和GSH-PX活性較常氧對照組顯著降低，經高劑量利舒康膠囊給藥后顯著升高。提示利舒康膠囊可抑制缺氧大鼠的氧化應激反應，減輕缺氧對大鼠肺組織造成的損傷。

LD和LDH是反映機體糖無氧酵解的兩個重要指標，LD既是糖無氧酵解的產物，又是糖異生的原料之一；LDH主要使乳酸脫氫生成丙酮酸，便于利用乳酸氧化功能，檢測這一指標可反映機體能量代謝的情況[18]。本研究結果顯示，缺氧模型組大鼠肺組織LD含量和LDH活性均較常氧對照組顯著升高，而利舒康膠囊給藥后，LD含量和LDH活性均明顯降低，提示利舒康膠囊能維持缺氧條件下機體對能量的消耗，延長大鼠的存活時間。

ATP是機體內主要的能量功能物質，而Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是參與主動運轉的離子泵的重要成分，在維持細胞內外離子交換的過程中起著重要的作用，可作為代謝紊亂和組織損傷恢復能力的重要指標[2,19]。本研究結果顯示，缺氧模型組肺組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶與常氧對照組相比顯著下降，而高劑量利舒康膠囊給藥后，肺組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型組，提示利舒康膠囊能在一定程度上緩解缺氧所致的能量代謝障礙。

綜上所述，利舒康膠囊可通過調節缺氧大鼠自由基代謝和能量代謝水平提高大鼠抗缺氧能力，其主要機制可能是減輕由H2O2和MDA等“毒性”物質對機體的損傷，加強糖酵解產能作用，維持機體生存所需的能量，減輕機體因能量不足而發生組織衰竭，從而進一步提高機體抗缺氧能力。