弱穩恒磁場環境下基于BiFeO3@TiO2復合納米顆粒體外光動力療法滅活HL60細胞試驗研究

趙 楊，劉麗玲，張啟云，方 杰，陳 麗，艾保全，熊建文*

(1.華南師范大學物理與電信工程學院， 廣州 510006； 2.廣東工業大學物理與光電工程學院， 廣州510006)

光動力療法(photodynamic therapy,PDT)具有的選擇性殺傷細胞、可與其他治療方法聯合使用等優點使其常用于生物醫學領域，并且在皮膚、腫瘤等疾病上已經成功地應用于臨床[1,2]。而光敏劑是影響光動力療法的重要因素之一，因此光敏劑的研發改進也就成為了科學家們研究的熱點。由于TiO2的毒性低、化學性質穩定、光催化活性較高，使其成為一種潛在的光敏劑。但是由于TiO2的寬帶隙(3.2 eV)，導致其可見光響應較低，表面生成的電子空穴復合率高，使其在PDT應用中受到一定限制。

針對TiO2可見光響應低等缺點，已經有較多的方法對TiO2進行改性，例如金屬摻雜、非金屬摻雜、量子點修飾、半導體復合等[3-7]。目前國內外很多研究學者考慮TiO2在PDT過程中的局限性，成功通過半導體復合的方式對TiO2進行改性修飾，提高了PDT對腫瘤細胞的滅活效率，但極少數研究者研究在PDT過程中引入外“加場”來增強光敏劑對白血病細胞的滅活效率。

本文通過引入具有較低生物毒性和良好分散性的半導體BiFeO3納米顆粒[8,9]，用溶膠凝膠法制備了核殼結構的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒，增強了TiO2的可見光響應，并且復合納米顆粒BiFeO3@TiO2的半導體異質結形成的內電場降低了電子空穴復合率[10-12]，此外，在保證磁場強度不直接損傷細胞的情況下，一定大小的弱穩恒磁場能夠影響納米顆粒光催化過程中電子空穴的遷移以及活性氧自由基的生成速率[13-18]。本文試驗證明了弱穩恒磁場環境能夠增強BiFeO3@TiO2復合納米顆粒體外光動力療法滅活HL60細胞的效果。

1 材料與方法

1.1 細胞株

早幼粒細胞白血病的細胞系(HL60)，由中山大學動物中心細胞庫提供。

1.2 試劑與儀器

鈦酸丁酯，硝酸鐵(FeN3O9·9H2O)，硝酸鉍(BiN3O9·5H2O)，乙二醇甲醚，無水乙醇，臺盼藍試劑(美國Invitrogen)，CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)，RPMI-1604培養基(美國Gibco)，活性氧檢測試劑(普利萊)。

X射線粉末演示儀(德國Bruker)，JEM-2100HR透射電子顯微鏡(日本JEOL)，UV-1700紫外可見分光光度計(日本Shimadzu)，WFY-28型熒光分光光度計(天津拓普)，SK2510LHC超聲儀(上海科導)，磁力加熱攪拌器(江蘇科析)，超微振蕩器(姜堰新康)，Countesstm型自動細胞計數儀(美國Invitrogen)，酶標儀(美國Bio Rad)，SW-CJ型潔凈工作臺(蘇州安泰)，HH·CP-TW(80 L)二氧化碳培養箱(上海一恒科技)，PDT反應室(自行設計)，96孔板及細胞計數板等其它常規器皿。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備復合納米顆粒BiFeO3@TiO2

BiFeO3的制備：稱取2.425 g硝酸鉍(BiN3O9·5H2O)溶解于20 mL乙二醇甲醚中，常溫下磁力攪拌30 min得到A溶液；稱取2.02 g硝酸鐵(FeN3O9·9H2O)溶解于20 mL乙二醇甲醚中，常溫下磁力攪拌30 min得到B溶液；將A、B溶液混合，常溫下磁力攪拌2 h后得到混合液C溶液；將C溶液置于鼓風干燥箱內90 ℃下15 h成干凝膠，取出研磨成粉裝入陶瓷坩堝，置于馬弗爐中以1 ℃/min的升溫速率升到550 ℃后保溫4 h，自然冷卻后取出，得到BiFeO3納米顆粒。

BiFeO3@TiO2的制備：稱取0.5 g的BiFeO3溶于15 mL無水乙醇磁力攪拌1 h;量取2.2 mL的鈦酸四丁酯加入其中，恒溫40 ℃超聲水浴1 h，之后置于鼓風干燥箱90 ℃下10 h；取出研磨裝入陶瓷坩堝，置于馬弗爐中以5 ℃/min的升溫速率升到500 ℃后保溫2 h，自然冷卻后取出，得到BiFeO3與TiO2質量比為1∶1的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒，標記為樣品1。重復此試驗方法，制備BiFeO3與TiO2質量比為1∶2和2∶1的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒，對應標記為樣品0.5和樣品2。

1.3.2 BiFeO3@TiO2復合納米顆粒的表征手段

用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)對BiFeO3@TiO2復合納米顆粒進行成像分析，檢測樣品的尺寸以及樣品分散性；X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀檢測樣品的衍射峰，根據衍射圖譜檢測樣品組成；熒光光譜(fluorescence spectre,FS)分析其激發光譜范圍、發射光譜范圍和強度等。

1.3.3 HL60細胞的培養與計數

將HL60細胞置于RPMI-1640完全培養基中，把整個培養基放入37 ℃、5%CO2、95%空氣濕度的二氧化碳培養箱中培養。培養適當時間后，取處于對數生長期的細胞進行試驗，換液打散至細胞液均勻，將此細胞液與臺盼藍按照1∶1的體積比例混合，使用Countesstm型自動細胞計數儀計數。

1.3.4 弱穩恒磁場增強BiFeO3@TiO2的復合納米顆粒PDT體外滅活HL60細胞的試驗

根據試驗內容對96孔板進行試驗設計規劃，試驗分為遮光組和光照組。遮光組包括：遮光板(A板)、遮光磁場板(B、C、D板)。光照組包括：光照板(E板)和光照磁場板(F、G、H板)。每個板設置試驗組和對照組。為了減少試驗誤差，同一條件設置3個重復孔。取對數生長期濃度為2×105個/mL的HL60細胞接種在已經規劃好的96孔板中。試驗組和對照組中每孔接種100 μL的細胞液。試驗組中各孔按照規劃加入終值質量濃度為50 μg/mL的TiO2和質量比為2∶1、1∶1、1∶2的BiFeO3@TiO2溶液100 μL，而對照組中加入血清含量為10%的RPMI-1640培養液100 μL，每孔的總體積為200 μL。把96孔板放到微量震蕩儀中震蕩5 min，用無水乙醇擦拭消毒96孔板后置于培養箱中培養。其中，遮光磁場板(B、C、D板)在培養12 h后，B、C、D板外加磁場分別對應為5、10、20 mT各1 h，光照板(E板)在培養12 h后，置于波長為410 nm、光功率密度為5 mW/cm2的光動力輻照室中光照1 h；光照磁場板(F、G、H板)在培養12 h后，置于相同光動力輻照室中光照且外加磁場強度分別為5 mT(F板)、10 mT(G板)、20 mT(H板)下各1 h，而遮光板(A板)則避光處理連續培養12 h。然后每孔加入20 μL的CCK-8試劑[19]，震蕩均勻后用無水乙醇擦拭消毒，置于培養箱再培養2 h。使用酶標儀，以450 nm為測量波長，630 nm為參比波長，對上述各板的試驗組和對照組進行細胞活性的吸光度檢測。

1.3.5 數據處理與分析

試驗數據主要采用Origin8.0，Mathtype，SPSS24.0軟件進行處理，結果用(均值±標準差)表示，如下是本試驗所用到的公式[20]：

計算細胞相對存活率的公式：

(1)

式中ODcontrol為對照組的OD值；ODtreat為試驗組的OD值。

計算PDT效率的公式：

(2)

式中ODirradiation為光照組的OD值；ODwithout-irradiation為遮光組的OD值。

2 結果與分析

2.1 復合納米顆粒BiFeO3@TiO2的表征

2.1.1 TEM成像分析

通過溶膠凝膠法制備的BiFeO3與TiO2質量比為2∶1、1∶1、1∶2的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒的TEM圖像如圖1所示。樣品0.5對應圖1a、1b、1c，樣品2對應圖1d，樣品1對應圖1e，圖1c中晶格間距0.39、0.27 nm分別對應BiFeO3的(101)面和(110)面，晶格間距0.35 nm對應銳鈦礦TiO2的(101)面。從圖1a、1b、1d、1e中可以看出BiFeO3顆粒被TiO2殼包裹，具有一定分散性，粒徑在20～90 nm之間，均小于100 nm，滿足納米顆粒進入細胞的尺寸條件，符合光敏劑的尺寸要求。

圖1 BiFeO3@TiO2納米顆粒的TEM圖Fig.1 TEM images of BiFeO3@TiO2 nanoparticles(a)BiFeO3@TiO2樣品0.5的TEM圖;(b)BiFeO3@TiO2樣品0.5的TEM圖;(c)BiFeO3@TiO2樣品0.5的TEM局部放大圖,白色線代表BiFeO3,紅色線代表TiO2;(d)BiFeO3@TiO2樣品2的納米顆粒TEM圖;(e)BiFeO3@TiO2樣品1的TEM圖(a)TEM image of BiFeO3@TiO2 sample 0.5;(b)TEM image of BiFeO3@TiO2 sample 0.5;(c)Zoomed up TEM image of BiFeO3@TiO2 sample 0.5,white lines represent BiFeO3 and red lines represent TiO2;(d)TEM image of BiFeO3@TiO2 sample 2;(e)TEM image of BiFeO3@TiO2 sample 1

2.1.2 XRD分析

TiO2、BiFeO3@TiO2納米顆粒的X射線衍射譜如圖2所示。由曲線1可見,在2θ=25.28°、37.80°、48.05°、53.89°、55.06°、62.69°等處出現了屬于銳鈦礦(101)、(004)、(200)、(105)、(211)、(204)晶面的衍射峰，曲線2在2θ=22.49°、31.80°、32.13°、39.50°、45.81°、51.37°、57.12°等處出現了屬于BiFeO3(101)、(012)、(110)、(021)、(202)、(113)、(300)晶面的衍射峰，峰型尖銳且無其他雜質峰。曲線3～5是不同質量比復合納米顆粒BiFeO3@TiO2的衍射譜，均出現TiO2以及BiFeO3的特征峰。

圖2 TiO2，BiFeO3@TiO2納米顆粒的X射線衍射譜Fig.2 XRD patterns of TiO2, BiFeO3@TiO2 nanoparticles

2.1.3 熒光激發光譜及光源分析

BiFeO3@TiO2納米顆粒在波長為630 nm的熒光激發光譜如圖3a所示。圖3b是BiFeO3@TiO2納米顆粒在410 nm處的熒光激發光譜放大圖。而本實驗室所使用的光動力輻照室的LED光源的發射光譜如圖3c所示，其發射峰為410.23 nm，光動力輻照室LED陣列的發光光譜與BiFeO3@TiO2復合納米顆粒在410 nm處的激發峰能夠很好地匹配，滿足可見光激發此納米材料的條件。

2.2 暗室條件下，弱穩恒磁場對HL60細胞的活性影響

從圖4中可以看出，暗室條件下，強度為5、10、20 mT的弱穩恒磁場在較短時間內對比沒有磁場作用的HL60細胞的活性沒有顯著影響，弱穩恒磁場本身在短時間內對細胞的生長無明顯促進或抑制作用。

圖3 納米顆粒的熒光激發光譜與光動力試驗箱LED陣列的發射光譜Fig.3 Fluorescence excitation spectra of nanoparticles andemission spectrum of LEDs of PDT irradiation chamber(a)BiFeO3@TiO2納米顆粒的熒光激發光譜;(b)BiFeO3@TiO2納米顆粒的熒光激發光譜局部放大圖;(c)光動力試驗箱LED陣列的發射光譜(a)Fluorescence excitation spectra of BiFeO3@TiO2nanoparticles;(b)Zoomed up fluorescence excitation spectra of BiFeO3@TiO2 nanoparticles;(c)Emission spectrum of LEDs of PDT irradiation chamber

圖4 磁場強弱對HL60細胞OD值的影響(P>0.05)Fig.4 Effect of magnetic field strength on OD value of HL60 cells(P>0.05)

2.3 暗室條件下，弱穩恒磁場作用下BiFeO3@TiO2復合納米顆粒對HL60細胞的毒性試驗

根據公式(1)計算HL60細胞的相對存活率，暗室條件下，如圖5所示，在沒有磁場作用下，可發現，樣品2、樣品1、樣品0.5、樣品TiO2對應細胞的相對存活率分別為78%、81%、85%、94%。復合納米顆粒BiFeO3@TiO2具有較低的生物毒性，并且隨著TiO2外殼厚度的增加，生物毒性越來越低，樣品0.5處理的細胞組在暗室條件下，細胞的相對存活率最高達到85%。

對于暗室條件下有弱穩恒磁場存在，磁場強度為5、10、20 mT時，樣品TiO2對應細胞相對存活率分別為92%、93%、91%；樣品2對應的細胞相對存活率分別為79%、78%、77%；樣品1對應細胞相對存活率分別為82%、80%、81%；樣品0.5對應細胞的相對存活率分別為84%、83%、84%。由此可知，在不同強度弱穩恒磁場作用下，各個樣品對各自細胞組的相對存活率影響無顯著性差異。此外，由圖5對比可看出，在暗室條件下，有無弱穩恒磁場對復合納米顆粒BiFeO3@TiO2作用的細胞活性無明顯影響。

圖5 暗室條件與弱穩恒磁場作用下不同外殼厚度BiFeO3@TiO2納米顆粒作用的HL60細胞相對存活率(P>0.05)Fig.5 Viability of HL60 cells treated with BiFeO3@TiO2nanoparticlesin different shell thickness under darkroom conditions and weak stable magnetic field(P>0.05)

2.4 光照條件下，BiFeO3@TiO2復合納米顆粒對HL60細胞存活率的影響

如圖6所示，在藥物終值質量濃度為50 μg/mL處理的HL60細胞中，光照組細胞的相對存活率明顯低于遮光組。此外，由圖看出，光照組在光照條件一致情況下，同一濃度不同納米顆粒作用的HL60細胞相對存活率依次為：樣品0.5<樣品1<樣品2<樣品TiO2，表明復合納米顆粒BiFeO3@TiO2有效提高了PDT的滅活效率，其中樣品0.5組對HL60細胞的PDT滅活效果最佳。

圖6 光照條件下，不同外殼厚度的BiFeO3@TiO2納米顆粒作用的HL60細胞相對存活率(P<0.05)Fig.6 Viability of HL60 cells treated with BiFeO3@TiO2nanoparticlesin different shell thickness under light exposure(P<0.05)

2.5 光照條件下，弱穩恒磁場作用下BiFeO3@TiO2復合納米顆粒對HL60細胞存活率的影響

從圖7a中可以看出，光照條件下，沒有外加磁場作用時的復合納米顆粒BiFeO3@TiO2處理的HL60細胞的相對存活率高于有外加磁場作用情況下的細胞組。對于光照條件下且有外加磁場作用的細胞組而言，磁場強度為5、10、20 mT時，TiO2對應細胞相對存活率分別為85%、82%、80%；樣品2對應的細胞相對存活率分別為38%、35%、33%；樣品1對應細胞相對存活率分別為32%、30%、28%；樣品0.5對應細胞相對存活率分別為24%、20%、18%。

圖7 HL60細胞的相對存活率與PDT滅活效率Fig.7 Viability and the PDT efficiency of HL60 cells(a)光照條件與弱穩恒磁場作用下不同外殼厚度BiFeO3@TiO2納米顆粒作用的HL60細胞相對存活率(P<0.05);(b)弱穩恒磁場作用下不同外殼厚度BiFeO3@TiO2納米顆粒對HL60細胞的PDT滅活效率(P<0.05) (a)Viability of HL60 cells treated with BiFeO3@TiO2 nanoparticlesin different shell thickness under light exposure and weak stable magnetic field(P<0.05);(b)The PDT efficiency of BiFeO3@TiO2 nanoparticles in different shell thickness on HL60 cells under weak stable magnetic field(P<0.05)

如圖7b所示，根據公式(2)可計算出HL60細胞的PDT滅活效率。光照條件下，沒有磁場作用時，樣品TiO2、樣品2、樣品1、樣品0.5對應的PDT滅活效率分別為7%、47%、54%、67%。光照條件下，磁場強度為5 mT時，樣品TiO2、樣品2、樣品1、樣品0.5對應的PDT滅活效率分別為8%、52%、61%、71%。光照條件下，磁場強度為10 mT時，樣品TiO2、樣品2、樣品1、樣品0.5對應的PDT滅活效率分別為11%、55%、63%、76%。光照條件下，磁場強度為20 mT時，樣品TiO2、樣品2、樣品1、樣品0.5對應的PDT滅活效率分別為13%、57%、65%、78%。對同一濃度的同一樣品而言，光照磁場組的細胞滅活效率高于光照組，而光照磁場組的細胞滅活效率又隨著磁場強度的增強而提高。對同一濃度的不同樣品而言，在同一光照條件與磁場強度作用下，HL60細胞的PDT滅活效率為：樣品TiO2<樣品2<樣品1<樣品0.5，終值質量濃度為50 μg/mL的樣品0.5處理的HL60細胞在20mT弱穩恒磁場作用下的PDT滅活效率最高達到78%。

2.6 納米顆粒PDT體外滅活HL60細胞機理分析

在PDT過程中，光敏劑能吸收特定波長的光子而從基態躍遷到激發態，然后將吸收的能量轉移到附近的氧氣分子產生單線態氧，或者與周圍的物質通過電子轉移發生光化學反應產生活性氧自由基，因此光敏劑介導產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)起到了關鍵作用[21]。

本文光敏劑主要是通過電子轉移產生更多的活性氧物質，來提升光動力療法的治療效果，因此光敏劑在410 nm熒光激發時,電子空穴復合率的降低可以提高光動力療法效率。如圖8的熒光發射光譜圖所示，光敏劑的熒光強度與電子空穴的復合率相關，光敏劑的電子空穴復合率越高則熒光強度值越大，反之亦然[22]。由圖8可看出，在沒有弱穩恒磁場作用下，樣品2、樣品1、樣品0.5均比樣品TiO2的熒光強度低，原因是半導體BiFeO3的引入使得復合納米顆粒BiFeO3@TiO2存在半導體異質結構，從而形成一個內電場使得電子空穴有效分離，降低了電子空穴復合率，其中樣品0.5的熒光強度最弱，電子空穴復合率最低。此外在20 mT弱穩恒磁場作用下，光敏劑的熒光強度相對于沒有磁場作用時也有所降低，也就是說弱穩恒磁場也能使電子空穴有效分離，進一步降低電子空穴復合率，從而提高活性氧產量增強光動力療法的治療效果。

圖8 不同外殼厚度BiFeO3@TiO2納米顆粒的熒光發射光譜(λex=410 nm)Fig.8 Fluorescence emission spectra of BiFeO3@TiO2 nanoparticles in different shell thickness (λex=410 nm)

3 討論

本文探究了弱穩恒磁場環境下基于BiFeO3@TiO2復合納米顆粒體外光動力療法滅活HL60細胞的試驗研究。采用溶膠凝膠法制備了核殼結構的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒，用TEM、XRD、FS對該光敏劑的粒徑、核殼結構、成分組成和激發光譜等性質進行表征，結果表明，BiFeO3@TiO2復合納米顆粒粒徑在90 nm左右，滿足光動力細胞試驗的要求。細胞試驗表明，復合納米顆粒BiFeO3@TiO2在暗室條件下具有較低的生物毒性，隨著TiO2殼厚度的增加，生物毒性降低。

半導體BiFeO3的引入使得復合納米顆粒BiFeO3@TiO2能被410 nm的可見光所激發，并且其形成的半導體異質結構使得光敏劑在特定波長光激發下的電子空穴復合率降低。此外，由熒光發射光譜圖間接表明，外加弱穩恒磁場能進一步使電子空穴復合率降低，弱穩恒磁場能夠影響光敏劑光催化過程中電子空穴的遷移，使得電子空穴有效分離，光敏劑與周圍的物質通過電子轉移發生光化學反應產生活性氧自由基。已有研究表明ROS對腫瘤細胞的直接毒性能使其壞死或誘導其凋亡、自噬，所以弱穩恒磁場環境下光生電子和空穴的分離效率更高,產生的ROS更多，PDT過程對HL60細胞的滅活效率就更高[13-18,20-22]。并且細胞PDT試驗顯示，沒有穩恒磁場作用的細胞組PDT效率明顯低于有穩恒磁場作用的細胞組，同時隨著弱穩恒磁場作用的增強，PDT效率也隨之提高。在本文試驗中，磁場強度分別為5、10、20 mT的弱穩恒磁場環境下的PDT試驗顯示，在磁場強度為20 mT的弱穩恒磁場環境下，PDT效率最高，如果繼續增大弱穩恒磁場強度，PDT效率是否隨之提高也是我們接下來需要展開的研究工作。

綜合以上分析，弱穩恒磁場環境能夠有效增強具有核殼結構的BiFeO3@TiO2復合納米顆粒體外光動力療法滅活HL60細胞的效果，同時為弱穩恒磁場環境下光敏劑體外光動力滅活白血病細胞提供了一定試驗數據，但如使其應用于臨床，仍需我們在后續工作中進一步深入研究弱穩恒磁場環境的影響機理。