新型冠狀病毒肺炎患者淋巴細胞及炎性指標的動態分析

郭斌 ，王強 ，任冠宇 ，杜琴 ，唐西 ，郭楊柳 ，謝寧 ，黃義山 ，郭曉蘭 （通信作者）

川北醫學院 1 醫學檢驗系，2 附屬醫院檢驗科，3 轉化醫學研究中心 （四川南充 637000）

新型冠狀病毒是一種在人體中新發現的冠狀病毒亞群，目前認為其來源于野生動物，并具有較強的傳染性[1-2]。新型冠狀病毒感染患者主要表現為發熱、咳嗽、全身乏力、肺炎等癥狀，重癥肺部感染患者易出現急性呼吸窘迫綜合征，進而導致呼吸衰竭、酸堿平衡紊亂和臟器損傷等并發癥[3-5]。世界衛生組織最新報告顯示，新型冠狀病毒感染患者較嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）患者病情進展不確定性更大，約80%患者以感冒輕癥為主，表現為自限性疾病，但具有傳染性；約15%患者出現肺炎，需要抗感染治療；約5%患者疾病進展快，病情兇險，需要進ICU治療；這種不確定性特征給臨床救治帶來了嚴峻的挑戰[6]。

目前，實驗室病毒核酸檢測和肺CT影像是診斷和監測新型冠狀病毒感染的重要依據，但是，核酸檢測假陰性的存在給臨床帶來了困擾，而陽性率較高的咽拭子、痰液和肺泡灌洗液由于受采樣量的影響，均無法對病毒進行準確定量，難以持續反映病情進展情況；放射性成像由于受到檢測環境和頻次的制約也有局限性[7-8]。相對而言，血液標本易于采集，且已有報道指出，針對病毒感染，血液中特定細胞數和炎性指標水平均在疾病診斷和監測中具有重要價值[9-10]，因此，探索這些指標在新型冠狀病毒感染患者病程中的動態變化，篩選潛在的抗感染評估指標具有重要的現實意義[11]。

本研究報道了新型冠狀病毒定點救治醫院（川北醫學院附屬醫院）早期收治的4例新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）患者流行病學史、臨床癥狀和入院檢查結果，分析了潛在的輔助診斷指標，連續記錄了患者在疾病治療過程中白細胞、淋巴細胞及炎性指標的水平變化，通過比較各指標與臨床肺部感染評分（CPIS）的相關性，為應用實驗室指標評估患者抗肺部感染療效、制定治療方案提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以國家衛生健康委員會辦公廳、國家中醫藥管理局辦公室印發的《關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版 修正版）的通知》為依據，納入確診病例和進行疾病診斷與病情分級。確診依據為：（1）呼吸道標本或血液標本實時熒光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測新型冠狀病毒核酸陽性；（2）呼吸道標本或血液標本病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。醫院2020年1月22日至2月10日收治了核酸檢測陽性的確診COVID-19患者4例，其中男2例，女2例；年齡46～77歲；入院判定為普通型2例，重型2例（1例迅速發展為危重型）。4例患者的臨床信息使用均遵照醫院醫學倫理委員會相關規定進行。

1.2 方法

定期采集所有隔離治療患者的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、動脈血、清晨非輸液端靜脈血（包括EDTA抗凝、肝素抗凝、枸櫞酸鹽抗凝和無抗凝劑血液標本），無抗凝管標本于36 ℃下孵育1 h 后，經3 500×g/min 離心10 min 分離血清。在嚴格質量控制下，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測新型冠狀病毒核酸（LightCycler96，之江試劑）；采用血氣分析儀測定患者氧分壓水平（GEM Premier 4000），采用全血細胞計數（BC 6800）、流式細胞術（BD FACSCanto Ⅱ）和紅細胞沉降動態掃描法（LDY2CX40）檢測患者全血標本白細胞（WBC）總數、淋巴細胞（LYM）總數、CD3 T 淋巴細胞數（CD3 T）、CD4 T淋巴細胞數（CD4 T）、CD8 T 淋巴細胞數（CD8 T）和紅細胞沉降率（ESR）；采用免疫散射比濁法檢測患者C反應蛋白（CRP）水平（BECKMAN AU5800）；采用化學發光法檢測患者降鈣素原（PCT）水平（axceed 260）；采用電化學發光法檢測患者白細胞介素-6（IL-6）水平（cobas e601）；采用免疫熒光法進行呼吸道病原體免疫球蛋白M（IgM）抗體聯合檢測分析呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌（歐盟試劑）；定期采用CPIS（綜合體溫、WBC計數、氣管分泌物、氧合情況、X線胸片、肺部浸潤影進展和氣管吸取物培養來評估感染嚴重程度的指標）對患者肺部感染狀況進行量化。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，使用Spearman等級相關系數對不同檢測指標連續變量與CPIS之間的相關性做回歸分析，P＜0.05為數據間具有相關性。

2 結果

2.1 COVID-19患者入院時的流行病學史和臨床特征

對4例患者的流行病學史、初診癥狀和基礎疾病史進行調查發現，發熱和肺炎是患者的主要癥狀表現；患者病情輕重未表現出年齡和基礎疾病相關傾向；2例患者感染途徑尚不完全明確，見表1。

表1 COVID-19患者入院時的流行病學史和臨床特征

2.2 COVID-19患者入院時的實驗室檢查結果和CPIS

對4例患者入院時的實驗室檢查結果和CPIS進行分析發現，所有患者均行呼吸道標本核酸檢測確診，并排除了甲乙型流感、其他病毒或細菌感染；血液細胞、血液生化及炎性指標均發生與疾病相關的水平改變，以LYM總數、T淋巴細胞數、IL-6、CRP和ESR變化最為普遍；1例有腹瀉癥狀的患者糞便樣本新型冠狀病毒核酸檢測呈陽性，見表2。

2.3 動態監測COVID-19患者實驗室檢查結果和臨床肺部感染情況變化

2.3.1 病例1、2、3實驗室檢查結果動態變化及與CPIS的相關回歸分析

3例患者在疾病全程均為單一新型冠狀病毒感染，實驗室相關連續監測指標結果見表3。由于PCT結果均正常且變化極小，所以將除PCT的其他檢測結果與CPIS做相關性分析，結果見表4；對5個（LYM 總數、CD3 T、 CD4 T、 CD8 T、CRP）與CPIS具有相關性的指標做回歸分析，均呈曲線相關，曲線擬合、r2和P見圖1（A、B、C、D、E）。

表2 COVID-19患者入院時的實驗室檢查結果和CPIS

表3 COVID-19患者白細胞、淋巴細胞、炎性指標動態監測結果及CPIS

表4 COVID-19患者動態監測指標與CPIS的相關性

2.3.2 病例4實驗室檢查結果動態變化及與CPIS的相關回歸分析

該患者在治療過程中病情突然加重，并合并細菌感染，實驗室相關連續監測指標及與CPIS的相關性分析結果見表5；CRP是研究中唯一與CPIS具有相關性的指標，對CRP與CPIS的相關性做回歸分析，兩者呈直線相關，線性擬合、r2和P見圖1（F）。

表5 COVID-19合并細菌感染患者白細胞、淋巴細胞、炎性指標動態監測結果及CPIS

圖1 COVID-19患者LYM總數（A）、CD3 T（B）、CD4 T（C）、CD8 T（D）、CRP（E、F）與CPIS的相關回歸分析

3 討論

本研究報道了川北醫學院附屬醫院早期經實驗室確診的4例COVID-19病例，其中2例患者感染路徑明確，另2例雖感染路徑尚未完全明確，但兩人均在發病前到過同一酒店參加婚宴，由于宴會廳相對密閉，通過飛沫或接觸傳播感染的可能性較大。發熱和肺炎是新型冠狀病毒感染患者的主要臨床表現，但1例腹瀉患者糞便核酸檢測陽性提醒我們需要警惕含有血管緊張素轉換酶2（ACE2）的臟器功能改變與新型冠狀病毒感染的關聯性[12]，醫務人員應注意甄別，以免誤診和漏診[13]。在患者入院檢測數據分析中，我們發現所有患者LYM總數和總T淋巴細胞數減低，淋巴細胞亞群CD4 T和CD8 T淋巴細胞數減低出現在大部分病例中，且病情越嚴重患者細胞減低幅度越大，表明新型冠狀病毒感染初期對患者免疫系統及淋巴細胞的消耗和破壞作用即廣泛存在[14-15]。炎性指標IL-6、CRP、ESR升高見于所有患者入院初檢，表明炎性指標在新型冠狀病毒感染中發揮重要的免疫作用；特別是CRP，一般病毒感染性疾病CRP不升高或輕度升高（＜25 mg/L），但在新型冠狀病毒感染患者中CRP顯著升高，為聯合淋巴細胞鑒別其他病毒感染性疾病提供了新的實驗基礎[16-17]。2例患者出現低白蛋白血癥，治療措施應包含營養支持方案；1例患者在疾病早期出現心肌酶譜檢測異常，提醒我們應注意新型冠狀病毒對心臟的攻擊和損傷，做好早期防范工作。

在進一步的研究中，我們連續監測了白細胞、淋巴細胞和炎性指標，研究表明，3例單一新型冠狀病毒感染患者的 LYM 總數及 CD3 T、CD4 T、CD8 T 淋巴細胞數與CPIS負相關，而CRP水平與CPIS正相關，表明這些指標的變化與患者肺部感染的病情進展有良好的相關性，在有條件的醫療機構推薦對患者T淋巴細胞進行流式計數常規監測；而在基層醫院，監測LYM總數+CRP的適用范圍更廣。在動態監測中未發現IL-6與CPIS有相關性，可能原因是IL-6對機體炎癥消退呈現高敏感性，在患者其他臨床指標并未恢復前IL-6即顯著降低，從另一角度表明了IL-6對患者預后的提示作用早于CRP，可供臨床在疾病診治中靈活使用[18]。3例患者在治療全程PCT水平均正常，有利于排除患者合并細菌感染的情況。ESR雖在疾病發生時升高，但由于其受機體內環境因素的影響多，所以在疾病監測中臨床意義不大。病例4在入院2 d后病情加重，合并細菌感染，導致表征疾病的指標在動態監測中變化更加復雜，LYM總數及T淋巴細胞數變化不再與CPIS相關，其原因是病毒合并細菌感染刺激了機體更多的免疫細胞參與抗感染過程，包括中性粒細胞、單核細胞等，單一種群的細胞已無法很好地評估臨床疾病狀況[19]；同時，病例4的IL-6和PCT水平隨病情變化更快、幅度更大，雖然與CPIS評分在統計學上無相關性，但兩者隨疾病變化的趨勢顯著，特別是在患者第5天的檢測中，IL-6和PCT水平顯著升高，提示醫務人員給予了患者緊急治療，從第7～9天，兩項指標水平逐漸下降，效果明顯，總之，IL-6和PCT水平對臨床及時制定抗感染、控制炎性指標風暴的治療方案起到了重要的作用；在病例4中，CRP是僅有的與CPIS具有相關性的指標，且呈直線相關，表明其與臨床肺部感染狀況存在密切的關系，在抗感染監測中可發揮重要的作用。

綜上所述，不同的細胞及炎性指標在COVID-19患者治療監測中發揮了不同的作用，臨床需選擇不同的實驗室指標用于單一新型冠狀病毒感染與病毒合并細菌感染患者抗肺部感染的療效評估；而新型冠狀病毒感染患者CRP的升高不僅與其他病毒感染患者存在區別，而且是本研究發現的唯一與不同病情新型冠狀病毒感染患者CPIS均具有相關性的指標，建議將其作為鑒別診斷和病情監測的關鍵指標應用于臨床。