花花柴抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY的鑒定及分析

余從巧 鄧 芳 趙紅山 徐靖辰 王彥芹，2*

（1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300）

自然條件下，極端溫度［1］、水脅迫［2］、鹽脅迫［3，4］、病原物［5］、氧化脅迫等因素都可能嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［6］。為降低由此帶來的惡劣影響，生物體通過自身的調(diào)節(jié)作用來抵御逆境脅迫［7］，其中WRKY家族起重要作用［8］。WRKYs是植物轉(zhuǎn)錄因子中較大的一類，其啟動(dòng)子靶點(diǎn)(W-box)具有(T)(T)TGAC(C/T)序列，它是由大約60 個(gè)保守殘基組成的DNA 結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域包含高度保守的WRKYGQK七肽［9］，因此而得名。

自Ishiguro 等從甘薯中克隆第一個(gè)WRKY 基因SPF1 以來［10］，研究人員已從玉米、水稻、擬南芥、可可、煙草、棉花等多種植物的根、葉片、花序、種子、微觀組織中克隆了超過500 個(gè)WRKY 基因的ESTs 序列。大量研究表明，WRKY 基因在抗旱、耐熱、抗鹽堿、抗病蟲害方面均有顯著的作用。例如：水稻中OsWRKY11 的過表達(dá)，可以使其抗旱性增強(qiáng)［11］；擬南芥AtWRKY39 的過表達(dá)，可以使植株耐熱性提高［12］；棉花的GhWRKY17 過表達(dá)，使其具有耐鹽堿的能力［13］；煙草中的NtWRKY3 和NtWRKY6 的基因沉默表達(dá)，可以使煙草抗煙草天蛾［14］。

自1994 年，WRKY 基因被爭(zhēng)相研究，水稻［15，16］、擬南芥［17］中對(duì)于WRKY 基因的描述與研究都相對(duì)詳盡，但其在花花柴中研究較少。花花柴（Kareliniacaspica）屬于菊科，花花柴屬，主要分布于內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅中部及新疆地區(qū)，生于戈壁灘、沙丘、草甸鹽堿地或葦?shù)厮锱浴Ｗ鳛樗死敻缮衬c綠洲的過渡植物，花花柴在防風(fēng)固沙方面有顯著的作用［18］，對(duì)沙漠植物花花柴抗逆性的研究，將有利于抗逆性植物及其基因資源的發(fā)掘和利用。本文以花花柴為研究對(duì)象，從本課題組已完成的常溫-高溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出差異表達(dá)的WRKY 基因（差異表達(dá)倍數(shù)在兩倍以上），從中挑選出兩個(gè)表達(dá)趨勢(shì)相反的基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，并將篩選出的15 個(gè)WRKY 基因與水稻、擬南芥中的WRKY 基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果對(duì)花花柴中WRKY基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)用品與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

花花柴植株樣品來源于塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)室，處理環(huán)境為塔里木大學(xué)逸夫?qū)嶒?yàn)樓氣候培養(yǎng)箱。按0、2、4、8、12（h）時(shí)間梯度摘取葉片，用液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TransGen Biotech 的試劑盒TransZolPlant、TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2*EasyTaq PCR SuperMix、液氮、TAE緩沖液、DEPC。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與工具

電子天平、PCR 儀（eppendorf 型號(hào)）、低溫高速離心機(jī)（eppendorf 5415R）、核酸微量分析儀（Thermo NanoDrop One）、電泳儀（BIO-RAD 型號(hào)）、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、水浴鍋、研缽。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

對(duì)前期本課題組已完成的花花柴常溫-高溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，篩選出15 個(gè)差異表達(dá)的WRKY基因，利用ggplot2 對(duì)其做熱圖分析。利用NCBI 中的ORF Finder 查找出WRKY 基因的開放閱讀框，利用MEME 在線軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；再利用MEGA6 和Clastx 將這15 個(gè)WRKY 基因與水稻、擬南芥中的WRKY 基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最后用PLACE 軟件對(duì)基因序列順式元件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1. 2. 2 高溫脅迫下花花柴WRKY 基因的表達(dá)模式分析

選擇有8-10 個(gè)葉片的室內(nèi)培養(yǎng)的花花柴植株，在恒溫氣候箱中45℃高溫處理，將摘取的幼嫩葉片利用試劑盒TransZolPlant 提取總RNA，再用TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix for PCR 的試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按時(shí)間梯度五個(gè)一組進(jìn)行表達(dá)模式分析。以cDNA 為模板，在PCR 管中加入Primer-R 0.4μL、Primer-F 0.4μL、模板1μL、2*EasyTaq PCR SuperMix 10μL，用ddH2O 補(bǔ)充至20 μl。用18S 與目標(biāo)基因進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花花柴WRKY基因家族的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析與篩選

以高溫（45℃）這一逆境條件處理花花柴2 h，對(duì)WRKY基因家族進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，其中綠色代表基因下調(diào)表達(dá)，而紅色代表基因上調(diào)表達(dá)。所研究的15 個(gè)基因中上調(diào)表達(dá)的占8 個(gè)，下調(diào)表達(dá)的占7 個(gè)（ 如 圖 1）。 其 中 CL1655. Contig1_All、Unigene16322_All、Unigene8397_All、Unigene20809_All、CL5354. Contig2_All、CL4493. Contig1_All、CL4493.Contig2_All、Unigene31044_All 在高溫處理下上調(diào)表達(dá)，其中Unigene31044_All 基因上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)最多，達(dá)3 109. 3 倍。 而Unigene19088_All、Unigene13217_All、 CL3390. Contig4_All、 Unigene24032_All、Unigene12940_All、Unigene10861_All、CL4998.Contig1_All在高溫環(huán)境下下調(diào)表達(dá)。

2.2 花花柴WRKY基因的保守序列分析

通過MEME 軟件比對(duì)分析（如圖2），發(fā)現(xiàn)15 個(gè)WRKY 蛋白均含有WRKY 家族絕對(duì)保守的氨基酸殘基WRKYGQK，有時(shí)也可采用WRKYGKK 的形式［9］，該結(jié)構(gòu)是WRKY 結(jié)構(gòu)域中的核心序列。 除WRKYGQK（WRKYGKK）序列具有高保守性，在第5位的D（天冬氨酸Asp）、第24 位的R（精氨酸Arg）、第26 位的Y（酪氨酸Tyr）、第29 位的C（半胱氨酸）同樣具有高保守性。

圖1 花花柴WRKY基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析熱圖

圖2 花花柴WRKY家族保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)

2. 3 花花柴及幾種模式植物WRKY 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過聯(lián)合建樹，將WRKY 基因家族分為7 個(gè)亞族，分別表示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（如圖3）。花花 柴Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655.Contig1_All 這3 個(gè)WRKY 基 因 在Ⅲ族；Unigene12940_All、CL4998. Contig1_All2 個(gè)WRKY 基 因在Ⅳ族；Unigene31044_All、CL5354. Contig2_All2 個(gè)WRKY 基 因 在Ⅴ族；CL3390. Contig4_All、CL4493.Contig1_All、CL4493. Contig2_All、Unigene19088_All4個(gè)WRKY 在Ⅵ族 中；Unigene20809_All、Unigene10861_All、Unigene24032_All、Unigene13217_All4個(gè)WRKY基因在Ⅶ族。

圖3 花花柴與擬南芥、水稻W(wǎng)RKY基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 花花柴WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能預(yù)測(cè)

在PLACE 軟件上對(duì)順式元件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，從表1 中可以發(fā)現(xiàn)篩選出的15 個(gè)基因中有共同的、與生態(tài)逆境有關(guān)的順式作用元件：ABR1 結(jié)合元件、CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、CuRE 核心序列、Nt-BBF1、KST1、MYB1AT、W 盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 識(shí)別位點(diǎn)、P 盒、LTRE 核心序列、HSE，在不同基因中順式作用元件的數(shù)量存在著一定的差距。如與高溫有關(guān)的HSE 熱激元件，僅在CL4998. Contig1_All 中存在。但大部分基因中含有與HSEs 共同促進(jìn)熱激啟動(dòng)子活性的CCAAT 盒。與低溫相關(guān)的有：LTRE-1、MYC識(shí)別位點(diǎn)、LTRE-1 核心序列，MYC識(shí)別位點(diǎn)在各個(gè)WRKY 基因中數(shù)量都較多。與干旱這一非生物脅迫有5個(gè)順式作用元件都與其相關(guān)，分別是：ABRE 類、KST1、ACGT 盒、MYB 識(shí)別位點(diǎn)、MYC識(shí)別位點(diǎn)。與抗病相關(guān)的元件W 盒也存在于各基因中，只是數(shù)量存在差異。

2.5 利用表達(dá)模式分析功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性

從15個(gè)差異表達(dá)的WRKY基因中篩選兩個(gè)表達(dá)趨勢(shì)相反的基因：CL4493. Contig1_All、CL4998. Contig1_All 進(jìn)行表達(dá)模式分析。由圖4 可以看出基因CL4493.Contig1_All 在未處理時(shí)有較少量的表達(dá)，高溫處理2 h 后表達(dá)量降低，在處理4 h 后表達(dá)量明顯升高，在處理8 h 后表達(dá)量較4 h 低，但較未處理時(shí)

高，在處理12 h 后表達(dá)量在整個(gè)處理時(shí)間中最高。基因CL4998. Contig1_All 在處理4 h 前表達(dá)量均較低，在處理4 h 后表達(dá)量增加，但是在8 h 后表達(dá)量降低，在處理12 h 后表達(dá)量增加在整個(gè)處理過程中達(dá)到最高。

表1 花花柴WRKY基因順式作用元件功能預(yù)測(cè)

圖4 CL4998.Contig1_All、CL4493.Contig1_All的表達(dá)模式分析

3 討論

近年來，在水稻［11］、擬南芥［12］、大豆［19］、煙草［14］、棉花［13］等植物中對(duì)于WRKY 基因的研究尤為火熱，闡述了WRKY 基因在非生物脅迫下至關(guān)重要的作用［20］，但是查閱大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)鮮少有關(guān)于花花柴這一荒漠植物該基因的研究。

本文主要是對(duì)基因進(jìn)行篩選分析，著重研究花花柴WRKY轉(zhuǎn)錄因子在高溫脅迫下差異表達(dá)的15個(gè)基因。這個(gè)數(shù)據(jù)相對(duì)于水稻中的84個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中的72 個(gè)WRKY 基因較少，但較煙草的11 個(gè)WRKY 基因多，因此分析花花柴WRKY 數(shù)量較少可能是物種間差異及生長(zhǎng)環(huán)境不同帶來的影響。通過熱圖分析，初步推斷高溫對(duì)基因的影響，在這15個(gè)基因中有8 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，7 個(gè)下調(diào)表達(dá)。我們將這15 個(gè)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)均含有WRKY 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域WRKYGQK（WRKYGKK），兩者最大的不同在于第6 位上的谷氨酰胺（Q）和賴氨酸（K）的不同，其中有14 個(gè)氨基酸是WRKYGQK，僅有Unigene20809_All 這個(gè)氨基酸為WRKYGKK。

通過對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹同亞族其他基因的功能分析，推測(cè)花花柴WRKY 基因可能存在的作用。在Ⅲ中與3 個(gè)花花柴WRKY 同源性較高的ATWRKY70 具有抵御干旱脅迫［21］、抗病［22］的功能，因此推測(cè)Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655. Contig1_All同樣具有抵御干旱脅迫、抗病的功能。在Ⅳ中與Unigene12940_All 同源性較高的ATWRKY39 具有抵御氧化脅迫［23］、應(yīng)對(duì)高溫脅迫［24］的功能，因此推測(cè)Unigene12940_All 在氧化脅迫、高溫脅迫響應(yīng)中有重要意義；與CL4998. Contig1_All 同源性較高的是ATWRKY7，該基因具有抗病［25］的功能，因此我們推測(cè)CL4998. Contig1_All 可能具有抗病的功能。在Ⅴ中與Unigene31044_All 同源性較高的ATWRKY61、與CL5354.Contig2_All 同源性較高的OsWRKY4 都具有抗病［26、27］功能，因此推測(cè)Unigene31044_All、CL5354.Contig2_All 在抗病方面有重要意義。在Ⅵ中與CL3390. Contig4_All 同源性較高的ATERKY34 具有應(yīng)對(duì)低溫脅迫［28］、影響雄性配對(duì)發(fā)生［29］的作用，因此推測(cè)CL5354.Contig2_All 在應(yīng)對(duì)低溫脅迫、影響雄性配對(duì)發(fā)生起重要作用；與CL4493. Contig1_All、CL4493. Contig2_All 同 源 性 較 高 的ATWRKY26 具 有抗高溫［24］、干旱、NaCl［34］脅迫的功能，可推測(cè)這兩個(gè)基因同樣具有以上功能；與Unigene19088_All同源性較高的ATWRKY33 具有抵御干旱、抗NaCl 脅迫［31］、抗 高 溫［32］及 抗 病［33］的 功 能，由 此 推 測(cè)Unigene19088_All 同樣具有以上功能。Ⅶ族中與Unigene20809_All 同源性較高的ATWRKY51、與Unigene10861_All 和Unigene24032_All 同源性較高的ATWRKY57、與Unigene13217_All 同源性較高的ATWRKY71都具有抗病［34，35］的作用，因此推測(cè)該亞族的4個(gè)花花柴WRKY基因具有抗病的作用。

通過預(yù)測(cè)順式作用元件功能發(fā)現(xiàn)，一個(gè)作用元件都不只存在于一個(gè)基因上，每一個(gè)順式作用元件也不只具有一個(gè)功能。ID 為Unigene10861_All 的基因中就含有CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、KST1、W盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 識(shí)別位點(diǎn)、HSE 等多個(gè)順式作用元件；ABRE 類也同時(shí)具有耐旱、缺氧、氧化脅迫等多個(gè)功能。每個(gè)順式作用元件的作用位點(diǎn)都有差別，它們利用各自耐旱、耐高低溫、抗病、耐鹽、抗氧化等相關(guān)功能，相互協(xié)調(diào)，共同作用，使同一植株中同一基因家族的不同基因表現(xiàn)出其差異性，發(fā)揮不同功能。針對(duì)外界不同程度的非生物脅迫調(diào)節(jié)自身的表達(dá)量，以此來適應(yīng)外界的變化，以維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

研究表明鹽脅迫［3］、激素、干旱［2］、病蟲害［5］、極端溫度［1］等非生物脅迫對(duì)WRKY 基因的表達(dá)量有一定的影響。AtWRKY25 和AtWRKY26 在未處理時(shí)均不表達(dá)，但在高溫處理后表達(dá)量明顯增加［36］。而通過對(duì)篩選出來的2個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)在對(duì)植株進(jìn)行高溫處理時(shí)，兩個(gè)基因存在相同的變化趨勢(shì)，即在處理前表達(dá)較弱，而在處理4 h 后基因的表達(dá)量均存在先增加后減少再增加的過程。該變化趨勢(shì)與前期測(cè)定花花柴對(duì)高溫脅迫響應(yīng)的生理變化趨勢(shì)一致，表現(xiàn)出脅迫-應(yīng)激-適應(yīng)的波浪式變化過程［37］。以上分析均說明高溫對(duì)WRKY 基因的表達(dá)量有明顯影響。

本研究為荒漠植物及其基因資源的發(fā)掘利用提供一定的參考價(jià)值，但僅對(duì)基因前期工作進(jìn)行探究，并未對(duì)基因的功能及調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行具體的研究，因此還需要后續(xù)更深入的功能分析。