鴿圓環病毒Cap及Rep基因的克隆與進化分析

日孜瓦古·努爾東 米曉云 魏玉榮 吳建勇 苗書魁 馬文戈 韓 濤 葛麗娟 魏 婕 黃 炯*

（1 新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊830052）

（2 新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊830013）

鴿圓環病毒（Pigeon circovirus，PiCV，也被稱為Columbid circovirus，CoCV）是圓環病毒科的一個成員，PiCV 可造成免疫抑制，繼而增加其他疫病感染風險。PiCV 感染主要發生在青年賽鴿及肉鴿，12 月齡以下的青年鴿較易感，4 月齡以下的鴿最易感［1］。因此，PiCV 感染又叫“青年鴿病綜合征”（Young pigeondisese syndrome，YPDS）。PiCV 呈球形，二十面體對稱，無囊膜，直徑為17 nm～22 nm，其基因組為單鏈環狀DNA，大小為1. 7 kb～2. 3 kb，有兩個主要的開放閱讀框（ORFs）V1和C1及第三個較小的ORF C2組成。ORF V1 定位于有義鏈上，編碼復制相關蛋白（Rep 蛋白）。ORF C1 位于反義鏈，編碼衣殼蛋白（Cap 蛋白）［2］。PiCV 最早在1993 年由Woods 等在美國加利福尼亞發現，隨后澳大利亞和許多歐洲國家也陸續報道發現PiCV［3-5］。余旭平等2007 年在中國浙江地區的病鴿體內首次檢測到PiCV 的存在［6］。本病是近20 年來青年賽鴿中普遍存在的問題，但是目前還未見到新疆對于該病毒感染情況的報道。本研究中對采集于新疆和田某規?；N鴿場的200 份糞便和3 份鴿病料應用本實驗室建立的PCR 方法進行PiCV 檢測，對檢測到的陽性樣品進行測序確認；隨機選擇測序陽性樣品進行Cap 及Rep 基因克隆、測序，應用DNAStar 軟件比對分析顯示所檢測陽性樣品病原來源一致，因此命名為PiCV-XJ2018；并應用MAGE5 將PiCV-XJ2018 與國內外30 余株PiCV 序列進行遺傳進化分析，以探究PiCV-XJ2018 可能的來源，為PiCV診斷及防控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1樣品來源及采集

從新疆和田的某規?；N鴿場采集3～4 月齡病鴿的糞便及病料（病鴿心、肝、肺、腸及喉管）備用。

1.2試劑

TIANamp Virus DNA/RNA Kit 購 自TIANGEN 生物公司（中國北京）；Kodaq 2×PCR MasterMix with dye，2 000 bp DNA Marker，15 000+2 000 bp DNA Marker、pMD19-T 載體試劑盒、限制性內切酶購自TAKARA；Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System、Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System購自Promega；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購自北京全式金生物。

1.3引物

下載GenBank 中多個PiCV 基因組序列進行比對（GenBank 登錄號：KX108805、KX431143、JF330089、KX108809、DQ090945），選擇序列保守區域設計Pigeon CV-U/Pigeon CV-D為檢測用引物，擴增長度為317 bp；Rep U/D為擴增Rep基因引物，擴增長度為992 bp；Cap U/D為擴增Cap基因引物，擴增長度為898 bp；3對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.4樣品檢測

根據TIANamp Virus DNA/RNA Kit 說明書對200份糞便樣品和3份病鴿肝臟組織樣品提取DNA，使用Kodaq 2×PCR MasterMix with dye 試劑盒對模板DNA進行PiCV 的PCR 檢測，PCR 擴增體系（總體積為25μL）：模板2μL，2×PCR MasterMix：12. 5μL，Pigeon CV-U/Pigeon CV-D 上下引物各0. 5μL，RNase Free dH2O：9. 5μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 擴增產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。符合預期條帶產物樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司（下文簡稱生工）測序。

1.5 Rep、Cap基因的PCR擴增

篩選上述樣品中的測序陽性樣品為模板擴增PiCV 的Rep、Cap 基因，PCR 擴增體系（總體積為50μL）：模板3μL，2×PCR MasterMix：25μL，上下引物：各1μL，RNase Free dH2O：20μL。PCR 擴增程序（1）Rep 基因：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存；（2）Cap 基因：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存；PCR 擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 Rep、Cap的基因克隆和測序

將PCR 產物目的片段經膠回收試劑盒純化后與pMD19-T 載體連接，轉化至Trans1-T1 感受態細胞，篩選、鑒定陽性克隆送生工測序。

1.7序列比較分析

測序序列經NCBI 中BLASTn 比對分析，再用Lasergenev7. 1 DNAStar 軟件進行序列整理和校對、拼接，將拼接后的核苷酸序列分別與GenBank中國內外鴿圓環病毒序列進行同源性比較，利用MEGA5.0 軟件繪制系統進化樹。

2 結果

2.1病料篩選結果

將PiCV 檢測引物擴增的PCR 產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果顯示200 份糞便樣品和3份病鴿肝臟組織樣品的PCR 產物中部分樣品可見約317 bp 的特異性片段，與預期大小相符（部分PCR 擴增結果如圖1）。任選6 份陽性PCR 產物送生工測序后，經BLASTn比對，證實為PiCV陽性。

圖1 部分樣品PCR鑒定

2.2 Rep、Cap基因擴增結果

從測序的6 份陽性樣品中隨機抽取1 份樣品作為模板DNA，進行PiCV 的Rep、Cap基因PCR 擴增，電泳結果顯示Rep、Cap 基因擴增可見約992 bp、898 bp的特異性片段，與預期大小相符（圖2）。將擴增產物進行回收、構建重組質粒后酶切鑒定（圖3、4）并測序。測序后的基因序列經BLASTn比對，確認是PiCV的Rep、Cap基因序列。

圖2 Rep、Cap基因擴增結果

圖3 Rep重組質粒鑒定

圖4 Cap重組質粒鑒定

2.3 Rep、Cap基因的同源性分析

用DNAStar 軟件中的MegAlign 對自測的Rep、Cap 基因分別與GenBank 中國內外PiCV 毒株相應的Rep 及Cap 基因序列進行比對。結果顯示自測PiCV-XJ2018 株Rep 基因與GF71/Guangdong/2014（KX108799）的同源性最高，其核苷酸同源性為97. 17%，氨基酸同源性為99. 05%；30 株Rep 基因核苷酸同源性在91. 9%～97. 2%之間；PiCV-XJ2018 株Cap基因與GF82/Guangdong/2014（KX108805）的同源性最高，其核苷酸同源性為94. 98%，氨基酸同源性為97. 79%；34 株Cap 基因核苷酸同源性在76. 3%～95.0%之間。

2.4 Rep、Cap基因進化樹分析

用MEGA5.0軟件分別對30株Rep基因（如圖5）、34 株Cap 基因構建進化樹（如圖6）。Rep 基因進化樹結果顯示，PiCV-XJ2018株與國內2014年廣東及上海地區的毒株處于一個大分支，說明它們親緣關系較近。Cap 基因進化樹結果顯示，所分析34 株毒株的Cap基因明顯分為5大組，PiCV-XJ2018株與大部分國內毒株處于基因B組，表明這些毒株親緣關系較近。

圖5 PiCV毒株Rep基因的系統進化樹

圖6 PiCV毒株Cap基因的系統進化樹

3 討論

PiCV 感染主要發生在青年賽鴿及肉鴿，12 月齡以下的青年鴿較易感，4 月齡以下的鴿最易感［1］。PiCV 不僅可通過環境如糞便、污染病毒的飼料及飲水等方式水平傳播，還具有經卵垂直傳播的風險［7,8］。2017年，臺灣學者對淘汰賽鴿中164羽死亡鴿子進行PiCV 檢測，有96. 95%（159/164）呈PiCV 陽性［9］。同年，有學者對收集于安徽、廣東、上海及江蘇的78 份鴿糞便、162份咽拭子及4份飲水樣品進行了PiCV 檢測，其中57.69%的糞便、1.23%咽拭子及25.00%飲水中檢測到PiCV［10］。鴿圓環病是一種免疫抑制性疾病，易使病鴿繼發感染其他疾病繼而致死，影響種鴿及賽鴿等生產性能及使用價值，危害鴿養殖業的發展，損害養殖戶經濟利益。新疆是否存在PiCV 及其感染情況如何，尚未發現相關文獻報道。

本研究中參考GenBank 中序列，設計了檢測引物，對采集的200 份糞樣及3 份病鴿肝臟組織樣品進行檢測，結果顯示有93 份糞便樣品和3 份病鴿肝臟組織樣品為陽性樣本，即陽性率47.29%。PCR 擴增陽性樣品隨機送樣6 份測序，經NCBI 數據庫比對測序的317 bp均為PiCV核酸片段。PiCV的Cap蛋白是病毒主要抗原蛋白，該蛋白與Rep 蛋白相比變異性相對較高，通常被用于遺傳進化分析［11］。Cap蛋白還與病毒免疫原性及致病性相關，被用于建立診斷或檢測方法［12、13］。本研究所測毒株PiCV-XJ2018 與國內外33 株PiCV 的Cap 基因遺傳進化分析可見，這34 株病毒被分為五大組（Group A-E），與前期研究報道結果一致［4］。PiCV-XJ2018 與2014 年廣東毒株及上海毒株處于同一分支，屬于基因B 組。PiCV-XJ2018 Cap 基因核苷酸與其他33 株同源性在76. 3%～95. 0%，與GF82/Guangdong/2014（KX108805）的同源性最高，達94. 98%，氨基酸同源性為97. 79%。PiCV-XJ2018 與國內外29 株PiCV 的Rep 基因遺傳進化分析可見，Rep 基因分為7 個大分支，其中PiCVXJ2018 仍與2014 年廣東毒株及上海毒株處于同一分支，與GF71/Guangdong/2014（KX108799）的同源性最高，其核苷酸同源性為97. 17%，氨基酸同源性為99. 05%；30 株Rep 基因核苷酸同源性在91. 9%～97. 2%之間。綜合Rep 和Cap 基因的遺傳進化分析可見，PiCV-XJ2018 與2014 年廣東毒株高度同源，親緣關系最近。

此次在新疆鴿群中檢測到種鴿感染PiCV，猜測可能與種鴿引種關系密切。此結果急需引起獸醫工作者及養殖戶的關注，需及時進行PiCV 感染現狀監測排查，對檢出陽性的種鴿場應進行隔離凈化。種鴿引種、育種及賽鴿放飛等環節避免PiCV 擴散。同時我們應加強有關快速診斷及防控產品研究［13］。

綜上，本文對新疆地區PiCV 進行調查，結果顯示被調查種鴿群存在一定比例PiCV 感染（陽性率47.29%），遺傳進化分析表明新疆該鴿廠發病毒株可能來源于廣東地區。