牛支原體與無乳支原體的相似性比對分析

韓楊 羅海霞 馬春驥 金華 李敏 郝秀靜

摘要：運用生物信息學方法對牛支原體（Mycoplasma bovis）和無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）的相似性進行多重比對分析。使用Mega 7、Clustal a、Sibeilia等生物信息學軟件對M.bovis與M.agalactiae的全基因組、16S rRNA、脂蛋白家族進行相似性比對分析。通過多重比對發現，M.bovis與M.agalactiae在全基因、16S rRNA、以及脂蛋白家族方面均表現出較高的相似性。

關鍵詞：牛支原體;無乳支原體;全基因組比對分析

中圖分類號：S858.236.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0398-06

Abstract： This study aims to conduct multiple comparative analysis on the similarity of Mycoplasma bovis ?and Mycoplasma agalactiae with the method of bioinformatics. M.bovis and M. agalactiae were compared for similarity in their whole genome， 16S rRNA， and lipoprotein families using bioinformatics softwares such as Mega 7， Clustal a and Sibeilia. Through the multiple alignment， M.bovis and M.agalactiae showed higher similarity in terms of whole gene， 16S rRNA and lipoprotein family.

Key words：Mycoplasma bovis;Mycoplasma agalactiae;whole genome alignment analysis

支原體為自然界中獨立生存的最小原核微生物，擁有能夠進行自我復制的最小基因組[1]。支原體能攻擊宿主細胞，引起宿主細胞的免疫反應并損害宿主細胞，以便在宿主細胞內生長繁殖[2]。牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種主要感染牛呼吸道的病原體[3]，能夠持續感染宿主[4]，并引發包括牛肺炎在內的多種慢性疾病[5]，如乳腺炎、中耳炎、生殖障礙、關節炎[6]、腦膜炎以及角膜結膜炎等[7]。M.bovis與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）在16S rRNA序列上有較高的相似性[8-11]。M.agalactiae也可以感染牛，并引發乳腺炎、角膜結膜炎和關節炎等疾病[12]，但主要會引起小型反芻動物的“傳染性無乳癥”（CA）綜合征[13]。所以在特異性檢測病原[14]甚至是根據特定的病原研制疫苗[15]預防疫病時就需要對二者進行精準區分[16]。為此我們擬通過對M.bovis與M.agalactiae的全基因組序列比對，探究二者在基因組層面的相似性，尋找兩者獨特的基因，為M.bovis快速檢測方法研究奠定基礎，為鑒定物種特異性提供更有效的證據。此外，我們還想探究二者分離株在16S rRNA上的親緣關系，以及主要毒力因子膜表面脂蛋白家族的相似性。

1材料與方法

1.1材料來源

從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）中找到牛支原體（Mycoplasma bovis）與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）的全基因組序列。

1.2統計分析

運用生物信息學軟件Mega 7構建M.bovis與M.agalactiae的16S rRNA、膜表面脂蛋白家族的系統進化樹，用Clustal w進行多重序列比對，用OrthoMCL v2.0.3對M.bovis（GenBank：CP002188.1）與M.agalactiae（GenBank：CU179680.1）的全基因組編碼的氨基酸序列進行比對（由北京基華生物技術服務有限公司進行）。使用OAT-ANI軟件對M.bovis與M.agalactiae進行全基因組共線性分析。

2結果

2.1M.bovis與M.agalactiae的基因組共線性

運用生物信息學軟件Sibelia對M.bovis的標準株PG45與M.agalactiae的標準株PG2進行全基因組共線性分析。由共線性圓形圖（圖1）可以發現，PG45與PG2之間有4個位置的基因具有共線性關系，說明M.bovis與M.agalactiae的標準株具有一定的相似性。

在M.bovis與M.agalactiae標準株表現出共線性的前提下，對M.bovis標準株PG45與M.agalactiae分離株5632進行全基因組共線性分析（圖2），對M.bovis分離株Ningxia-1與M.agalactiae分離株5632也進行了全基因組共線性分析（圖3）。結果表明M.bovis與M.agalactiae不僅在標準株中具有共線性關系，在分離株中同樣存在共線性關系，說明二者在基因組共線性層面上具有相似性。

2.2M.bovis與M.agalactiae的全基因組比對分析

采用OrthoMCL v2.0.3軟件對M.bovis（GenBank：CP002188.1）與M.agalactiae（GenBank：CU179680.1）的全基因組編碼的氨基酸序列進行比對，選取閾值（BLASTP E值不大于1×10-5，MCL_INFLATION值=1.5）進行相似性聚類，獲得同源基因的列表，以確定M.bovis與M.agalactiae的同源性。

比對結果顯示， M.bovis與M.agalactiae之間共有基因家族472個。使用MUSCLE v3.7軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）將每個單拷貝基因家族中各成員進行全序列比對。結果（圖4）表明，牛支原體（M.bovis）特有基因數量為285，無乳支原體（M.agalactiae）特有基因數量為279，牛支原體與無乳支原體共有的基因家族數量為472。M.bovis與M.agalactiae共有的基因家族高達472個，說明二者具有較高的相似性和較近的親緣關系。

為了進一步探究M.bovis與M.agalactiae在基因組層面的相似性，使用生物信息學軟件Jspecies對M.bovis與M.agalactiae進行全基因組平均核苷酸序列同源（ANI）分析。平均核苷酸序列同源性是通過比較物種全基因組同源基序列判定物種間遺傳關聯性的重要參數。對M.bovis及M.agalactiae全基因組序列比對分析后得到的ANI值高達83.08%，再次說明M.bovis與M.agalactiae具有較高的相似性。

2.3支原體16S rRNA系統進化樹

在NCBI中找到M.bovis標準株PG45和M.agalactiae標準株PG2的16S rRNA堿基序列，并運用生物信息學軟件Clustal w對二者進行多重序列比對（圖5），發現相似性高達97%。由于二者16S rRNA堿基序列相似度過高，為了探究M.bovis與M.agalactiae間的親緣關系，在NCBI中找到較常見的11種支原體16S rRNA堿基序列，并找到NCBI中M.bovis與M.agalactiae其余分離株的16S rRNA堿基序列，使用生物信息學軟件MAGA 7構建系統進化樹（圖6），由進化樹可以看到M.bovis與M.agalactiae無論標準株還是分離株，均位于同一分枝上，且親緣關系較近。

2.4M.bovis與M.agalactiae的16S rRNA相似性

對16S rRNA進行生物信息學分析后，使用引物設計軟件Primer Premier 5隨機對M.bovis的16S rRNA堿基序列設計4對引物，同時以M.bovis與M.agalactiae基因組DNA為模板進行PCR擴增。結果（圖7）顯示，M.bovis與M.agalactiae均擴增出明亮的目的條帶，再次證明二者在16S rRNA層面的相似性。

2.5M.bovis與M.agalactiae表面可變脂蛋白家族進化樹

在NCBI中找到M.bovis與M.agalactiae的表面可變脂蛋白家族的基因序列，運用生物信息學軟件MAGA 7構建M.bovis與M.agalactiae表面可變脂蛋白家族的進化樹。結果（圖8）顯示，M.bovis的Vsps家族可細分為3個亞類，M.agalactiae的Vpma家族與其中一類的親緣距離較近，表面可變脂蛋白家族進化的層面上說明M.bovis與M.agalactiae的親緣關系較近。運用生物信息學軟件Clustal w，在M.bovis與M.agalactiae的表面可變脂蛋白家族中相似性較高的多條序列中，各選擇2條進行多重序列比對（圖9），發現M.bovis與M.agalactiae也顯示出相似性。說明M.bovis與M.agalactiae不僅在16S rRNA堿基序列上相似，在與感染致病相關的高度變異的表面可變脂蛋白方面上也表現出相似性。

3討論

支原體會感染人類[17-19]和動物[20-22]，而且往往難以根除[23]。雖然治療支原體病具有較大的社會經濟意義[24]，但由于缺乏對支原體致病機制[25]的認識，目前正確預防并控制支原體病疫情還未成系統。牛支原體病的高傳染性和低治愈率[26]對中國牛養殖業的健康發展造成了巨大威脅，作為寧夏回族自治區農業特色優勢產業之一的牛養殖業[27]，同樣受到該病的潛在威脅[28]。本課題組在建立M.bovis的快速檢測方法時，篩查特異性基因的過程中發現M.agalactiae和M.bovis具有極高的相似性。所以本研究運用生物信息學軟件分析了M.bovis和M.agalactiae的相似性，這對M.bovis快速檢測方法的建立具有實際意義。

全基因組序列比較結果表明M.bovis與M.agalactiae共有的基因家族高達472個，占全基因組的2/3。M.bovis與M.agalactiae的ANI值高達83.08%，二者分屬于不同種的支原體，但相似性之高顯而易見。16S rRNA堿基序列比對以及進化樹分析結果也揭示了M.agalactiae和M.bovis在16S rRNA堿基序列上的相似性。表面可變脂蛋白家族為支原體主要的毒力因子[29]。氨基酸序列比對結果顯示， M. agalactiae的Vpma與M.bovis的Vsp具有高度的氨基酸序列相似性。表面可變脂蛋白家族進化樹顯示，Vpma家族與Vsp家族中的一類親緣距離較近。對Vsp家族和Vpma家族的相似性分析不僅可以在表面可變脂蛋白家族的層面上驗證M.bovis與M.agalactiae的相似性，也可以探究M.agalactiae的致病機制。M.bovis的Vsp蛋白已被證明參與宿主細胞粘附[30]，但是關于M.agalactiae Vpma蛋白的確切功能未見報道。通過Vsp家族和Vpma家族的相似性分析，或許可以推測M.agalactiae的Vpma蛋白也參與宿主細胞粘附[31]。多方面比對結果都表明M.bovis與M.agalactiae具有較高的同源性，所以在建立檢測方法時要將二者進行區分[32]。

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（責任編輯：張震林）