穩定表達HBx的人肝細胞系7702的建立*

龐麗君，石 英，郭向華，喬錄新，時紅林，王珊珊，劉 凱

HBVX蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是由HBV編碼的蛋白之一，基因長度為465 bp，編碼154個氨基酸，是一種潛在的多功能致癌蛋白，在慢性乙型肝炎進展為肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)過程中發揮重要作用[1,2]。長期HBV感染、HBV大量復制、HBV不同的基因型、HBV DNA與宿主肝細胞基因組的整合、特定的HBV突變體和HBV編碼的癌蛋白，如HBx和截短的pres2/s蛋白等，都是HBV促進HCC發展的危險因素[3]。雖然HBx基因是HBV基因組中最小的片段，但它是一種多功能的病毒調節因子， 通過調節細胞和病毒的轉錄活性、蛋白質降解、信號傳導途徑等，直接或間接地影響 HBV復制，并且能調控細胞周期和細胞凋亡，從而在慢性肝炎和肝硬化發展至腫瘤過程中發揮作用[4, 5]。HBx作為病毒反式激活因子，通過與腫瘤微環境中不同組分長期相互作用導致腫瘤的發生[6]。為了進一步探討HBx基因在乙型肝炎相關HCC發生發展過程中的調控機制，我們構建了HBx表達質粒，選取肝病研究最常用的人正常肝細胞HL-7702(normal human liver cell 7702，HL-7702)系，在HL-7702細胞中轉染HBx重組質粒并篩選出可穩定表達HBx的HL-7702細胞系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 表達HBV的人肝癌細胞系HepG2.2.15細胞、人腎上皮細胞系293細胞(HEK 293)和人正常肝細胞系7702(HL-7702)細胞由本實驗室保存。pIRES載體購買于Clontech公司。 T4連接酶、限制性內切酶Nhe I和Xho I為Fermentas公司產品。Taq DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α、反轉錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA marker、蛋白marker等購自北京博邁德基因技術有限公司。PBS緩沖液、Western blot電泳緩沖液、Western blot電轉緩沖液、RIPA蛋白裂解液等購自北京索萊寶科技有限公司。氨芐青霉素、TRIZOL、G418和DMEM培養基為Sigma公司產品，胎牛血清為Gibco公司產品。轉染試劑Lipofectamine3000購自Thermo fisher 公司。Western blot和免疫熒光檢測所用抗HBx抗體購自Abcam公司。胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂糖等化學試劑購自OXOID公司。

1.2 擴增目的基因 采用TRIZOL提取HepG2.2.15細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，應用以下引物擴增HBx基因片段。擴增引物序列如下，上游引物P1: 5’-CGGGCTAGCATGGCTGCTAGGGTG- 3’，下游引物P2：5’- CCGCTCGAGCTAGGCAGAGGTGAA- 3’，Nhe I內切酶識別序列為CGGCTAGCCG， Xho I內切酶識別序列為CCCTCGAGGG。PCR反應體系如下： 2×PCR mix取 25μl；上游引物P1取 1μl，下游引物P2 取1μl；cDNA模板取2μl，dH2O取 21μl，總體積為50μl。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，57℃復性30 s，72℃延伸30 s，共30個循環。72℃再延伸5 min。擴增產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用膠回收試劑盒對符合預期大小的片段進行切膠回收。

1.3 構建pIRES-HBx表達載體 利用限制性內切酶Nhe I和XhoI，分別對上述PCR產物和載體pIRES (Clontech)進行雙酶切，兩者的酶切條件分別為37℃，30 min和37℃，2 h。將上述酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后利用切膠回收目的基因和載體片段。用T4 DNA連接酶將酶切后回收的目的基因片段連接到載體pIRES的Nhe I和Xho I酶切位點之間，反應體系和反應條件如下：T4 DNA連接酶1 μl，5×T4 DNA連接酶緩沖液2μl，載體pIRES 1μl，PCR產物4μl，dH2O 2 μl，總體積為10μl；室溫孵育10 min。然后，取上述連接產物5μl加入DH5α大腸桿菌50μl中進行轉化，用氨芐青霉素進行篩選，次日挑取多個單克隆，37℃過夜搖菌后進行小型質粒提取，將構建的重組質粒命名為pIRES-HBx。

1.4 重組質粒的鑒定 利用Nhe I和XhoI限制性內切酶對提取的多個重組質粒pIRES-HBx進行Nhe I和Xho I雙酶切，酶切體系和條件如下: pIRES-HBx重組質粒1μg, Nhe I和XhoI限制性內切酶各1μl,10×酶切緩沖液 2μl, 補dH2O至總體積為20μl。將上述酶切混合物放入37℃水浴鍋孵育30 min。然后，經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定插入片段的大小。取片段大小正確的多個重組質粒，送到博邁德公司進行測序和鑒定，最后選擇測序結果與原序列一致的重組質粒。

1.5 細胞重組質粒表達檢測 利用Lipofectamine 3000轉染試劑，將空白載體pIRES和 pIRES-HBx質粒分別轉染至HEK 293細胞和HL-7702細胞。細胞培養48 h后收集細胞，用TRIZOL和 RIPA裂解液提取mRNA和蛋白，分別采用Real-time PCR和Western blot法檢測HBx基因mRNA水平和蛋白表達情況。

1.6 穩定轉染細胞系的篩選和鑒定 將pIRES對照載體和pIRES-HBx重組質粒，分別轉染至HL-7702細胞。待細胞培養48 h后，用1 mg/ml G418抗生素篩選細胞。篩選14 d后，繼續用0.5 mg/ml G418 DMEM完全培養基維持培養兩個細胞系1 w。然后，采用免疫熒光技術檢測HBx蛋白表達，在熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 HBx CDS片段擴增情況 首先，以HepG2.2.15細胞cDNA作為模板，用上述引物P1和P2擴增HBx基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見單一條帶，其片段大小與預期的465 bp一致(圖1)。

1：DNA marker；2：PCR產物圖1 PCR擴增獲得的HBx基因片段 利用HepG2.2.15細胞cDNA和特異性引物擴增HBx基因片段，可見單一明亮條帶，大小與目的基因相符

2.2 HEK 293細胞和HL-7702細胞HBx mRNA水平檢測情況 將上述擴增產物連接至pIRES載體，構建過表達HBx的重組質粒pIRES-HBx。經雙酶切和測序鑒定，插入載體的DNA片段符合HBx CDS區大小，測序結果與HBx CDS序列完全一致。為了進一步探討重組載體在細胞系是否能正常工作，我們選擇了兩個細胞系HEK 293細胞和HL-7702細胞，在這兩個細胞系中分別轉染pIRES載體和pIRES-HBx質粒。48 h后，收集細胞，提取RNA并逆轉錄成cDNA，經實時熒光定量PCR法檢測兩種細胞HBx mRNA水平，以GAPDH基因作為內參，結果發現轉染pIRES-HBx質粒的兩種細胞HBx mRNA水平均顯著高于對照組細胞(圖2)。

圖2 熒光定量PCR法檢測細胞HBx mRNA水平 在HEK 293和 HL-7702細胞系，分別轉染pIRES載體和pIRES-HBx重組質粒，48 h后收集細胞提取RNA并通過熒光定量PCR法檢測，結果在兩個細胞系中，轉染pIRES-HBx重組質粒細胞HBx mRNA水平顯著高于對照細胞

2.3 HBx蛋白表達情況 我們在HEK 293細胞和HL-7702細胞，分別轉染pIRES載體和pIRES-HBx質粒。 48 h后收集細胞，加RIPA裂解液，提取總蛋白，行蛋白定量后，采用Western blot法檢測HBx蛋白表達，以β-actin作為蛋白對照。結果發現，無論在HEK 293細胞還是HL-7702細胞，與轉染pIRES載體對照組比，轉染pIRES-HBx質粒細胞HBx蛋白表達顯著增強(圖3)。我們從mRNA水平和蛋白表達兩個方面驗證了pIRES-HBx質粒能夠在轉染細胞過量表達HBx，可以用于下一步穩定篩選細胞系。

1：HEK 293細胞轉染pIRES； 2：HL-7702 細胞轉染 pIRES； 3：HEK 293細胞轉染pIRES-HBx； 4：HL-7702細胞轉染pIRES-HBx圖3 免疫印跡法檢測細胞HBx蛋白表達 在HEK 293和 HL-7702細胞，分別轉染pIRES載體和pIRES-HBx重組質粒，48 h后收取細胞，裂解，采用Western blot法檢測，結果顯示轉染pIRES-HBx重組質粒細胞HBx蛋白大量表達

2.4 可穩定表達HBx的人7702細胞的構建與鑒定 首先，在HL-7702細胞，轉染pIRES載體和pIRES-HBx質粒，轉染48 h后在培養基里加入高濃度的G418，篩選細胞，最后用0.5 mg/ml G418 DMEM完全培養基維持培養，篩選穩定轉染HBx的HL-7702細胞系。為了驗證穩定篩選是否成功，用兔抗人HBx單克隆抗體和免疫熒光技術檢測HBx蛋白表達。在轉染pIRES-HBx質粒的細胞，可見HBx大量表達(圖4)，由此證明我們成功構建了穩定表達HBx的HL-7702細胞系，大量擴增細胞后將細胞凍存于液氮中保存，為后續對HBx的調控機制及其功能研究提供了細胞基礎。

DAPI: 細胞核熒光染料；HBx：抗HBx抗體；合并圖像：將DAPI和HBx熒光圖合并圖4 免疫熒光法檢測穩定轉染的HL-7702細胞HBx表達 在HL-7702細胞，轉染pIRES載體和pIRES-HBx重組質粒，篩選，采用細胞免疫熒光技術檢測，發現轉染pIRES-HBx重組質粒細胞HBx大量表達

3 討論

HBV感染可導致一系列肝臟疾病，是人類健康的重大問題之一，每年引起全世界有超過一百萬人死亡[7]。已有研究證明HBx蛋白對HBV的復制是非常必要的，在細胞核中HBx與HBV cccDNA和基本轉錄機制相互作用并激活轉錄。在細胞質中，HBx通過刺激信號轉導通路從而促進病毒復制，包括影響細胞存活、代謝、增殖和轉錄途徑[6]。HBx可以與宿主胞內多種蛋白相互作用進而促進HBV的復制[8,9]。HBx是HBV基因轉錄所必需的作用因子，在乙型肝炎病毒致病過程中起重要作用，HBx可直接或間接改變肝臟細胞的結構和功能，進而引發肝細胞的凋亡[10]。HBx還能通過與miRNA的相互作用影響許多腫瘤過程，如增殖、凋亡、侵襲、轉移、分化和脂肪形成等[11,12]。

HCC是一種具有高致死性的常見惡性腫瘤，大部分HCC的發生都與慢性HBV感染密切相關。HBV可以通過多種機制加速HCC的形成。首先，HBV誘導相應的免疫應答，誘導肝臟出現反復的炎癥反應直至纖維化；隨后，HBV可通過DNA整合修飾插入附近的宿主基因，從而導致宿主細胞基因組不穩定并產生致癌融合蛋白[9]。HBV感染后會通過干擾細胞信號傳導途徑和表觀遺傳學的調節，實現HBV介導的細胞凋亡。關于細胞凋亡的HBV干擾存在相互矛盾的報道，其中大部分報道顯示其抑制凋亡效應，但部分研究報道HBV會誘導細胞凋亡[13-15]。HBV可表達多種活性蛋白，尤其是HBx和HBs，它們具有一系列反式激活功能，HBV感染會干擾細胞凋亡信號傳導，從而促進HCC的發展進程和病毒增殖，其中HBx蛋白在細胞凋亡的干擾中起主要作用。HBx還可以干擾細胞氧化應激和DNA修復反應、信號轉導和細胞周期進展。HBx在HBV相關的HCC組織經常呈高表達，并通過多種機制，如調節細胞存活、增殖相關基因與細胞內蛋白的相互作用和調節不同的信號通路等，促進HCC的發生[16-18]。

HBV感染已被公認是HCC的主要危險因素，進一步的研究也表明HBx是HBV感染后肝癌發生的關鍵環節之一。HBx通過調節轉錄、信號轉導、凋亡、蛋白質降解和DNA修復參與并影響肝癌的發生[14, 19]。全面了解HBV感染如何誘導和影響HCC的發生發展對于開發更有效的抗病毒治療藥物和預防肝硬化和HCC的發生非常重要[20]。因此，為了進一步探討HBx在HBV感染和HCC發生發展進程中的作用機制，我們構建了HBx過表達質粒，并成功篩選出穩定表達HBx的HL-7702細胞系，為后續HBV相關肝病發病機制研究和改進臨床療法提供了基礎科研工具。