芒果苷減輕缺氧復氧所致人心肌細胞損傷

李 剛，余朝萍，龔厚文，劉天虎

（成都市郫都區人民醫院心血管內科，四川成都611730）

冠心病和心肌梗死是嚴重威脅人類生命的主要疾病之一，心肌梗死后血運重建過程中可能造成心肌缺血再灌注損傷，加重心肌細胞缺血和凋亡［1］。心肌細胞為終末分化細胞，不可再生，抑制心肌細胞凋亡將會對缺血再灌注損傷的心肌起著非常重要的保護作用。芒果苷（mangineferin，MAG）是一種天然的多酚類物質，廣泛存在于許多藥材如百合科植物知母以及芒果的果實、皮和樹葉中。大量研究表明，芒果苷在抗糖尿病、抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及免疫調節等方面具有廣泛的藥理作用［2］。已有研究表明芒果苷對柔紅霉素所致的心肌細胞凋亡具有抑制作用［3］。然而，芒果苷對受損心肌細胞的保護效應及作用機制仍不明確。據此，本研究擬通過建立人心肌細胞缺氧復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，深入探討芒果苷對缺氧復氧心肌細胞的保護效應及機制。

材料和方法

1 材料

人心肌AC16細胞株購自ATCC。抗Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和超氧化物岐化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）抗體，鼠抗兔 HRP-IgG，兔抗鼠HRP-IgG（Cell Signaling Technology）；抗核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）抗體（Santa Cruz）；抗Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1，Keap-1）抗體（Proteintech）；活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）熒光探針DCFH-DA（Solarbio）；CCK-8試劑盒（Sigma）；RPMI-1640培養基、胎牛血清和蛋白核質分離試劑盒（NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents）均購自 Thermo Fisher；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Vazyme）。

2 方法

2.1 實驗分組及H/R模型的建立 將AC16細胞分為：（1）正常（normal）組；（2）H/R 組；（3）H/R+低劑量（50 μmol/L）芒果苷（MAG-L）組；（4）H/R+中劑量（100 μmol/L）芒果苷（MAG-M）組；（5）H/R+高劑量（200 μmol/L）芒果苷（MAG-H）組。將AC16細胞于CO2培養箱常規培養后接種至不同培養板中，用含10%FBS的DMEM培養基培養24 h后棄培養基，PBS洗2遍，換成用混合氣（95%CO2+5%N2）預飽和過的無糖DMEM培養基（不含FBS），同時將細胞轉移至缺氧小室中，持續通入混合氣（95%CO2+5%N2）10 min，夾緊進氣管和出氣管，置于CO2培養箱中培養12 h。缺氧完畢后，換成完全培養液（高糖DMEM+10%FBS），置于CO2培養箱常規培養6 h。

2.2 CCK-8法檢測細胞活力 取處理后的AC16細胞，以5×107/L接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養箱培養。接種12 h細胞貼壁后，按各組要求繼續培養48 h，然后用CCK-8法測定各孔吸光度（A），設定低氧組細胞活力為1，其余各組相對細胞活力等于各組A與對照組A比值。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 按照Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書中對貼壁細胞的處理及檢測方法對AC16細胞的凋亡進行流式細胞術檢測。

2.4 RT-qPCR法測定RNA的表達水平 用OMEGA總RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，進行逆轉錄及實時熒光定量PCR反應，按操作說明書進行。引物序列見表1。反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸20 s，40個循環。

2.5 Western blot檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、SOD2、Nrf-2和Keap-1的蛋白表達水平 裂解細胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后取50 μg蛋白進行SDS-PAGE，濕轉法轉移蛋白至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，1∶1 000稀釋的抗Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、SOD2、Nrf-2和Keap-1抗體4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜3次，每次10 min，用相應的HRP標記的II抗（1∶3 000稀釋）室溫孵育1 h后，TBST振搖洗膜3次，每次10 min。ECL底物化學發光顯色后機器掃描存盤，以ImageJ軟件進行條帶分析。

2.6 ROS的檢測 按照1∶1 000用無血清培養基稀釋DCFH-DA。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFHDA中，細胞密度為1×109～2×1010/L，37℃細胞培養箱內孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次。用無血清培養基洗滌細胞3次，收集細胞后用熒光分光光度計檢測，使用488 nm激發波長，525 nm發射波長。

表1 用于RT-qPCR實驗的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統計學處理

應用SPSS 22.0進行統計，結果以均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 芒果苷對缺氧復氧心肌細胞凋亡及活力的影響

CCK-8實驗和流式細胞術結果顯示，缺氧復氧導致心肌細胞活力下降，凋亡率增加（P＜0.05)；各劑量芒果苷均可顯著增強缺氧復氧心肌細胞活力，抑制其凋亡（P＜0.05）；中、高劑量組效應明顯強于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無明顯差異，見表2及圖1。

2 芒果苷對缺氧復氧心肌細胞miR-432-3p表達的影響

RT-qPCR結果顯示，相對于正常組，缺氧復氧對AC16細胞miR-432-3p表達無明顯影響；各劑量芒果苷均可顯著升高缺氧復氧心肌細胞miR-432-3p表達（P＜0.05）；中、高劑量組效應明顯強于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無明顯差異，見表3。

3 芒果苷對缺氧復氧心肌細胞氧化應激反應的影響

相對于正常組，經缺氧復氧處理后，心肌細胞內ROS水平顯著升高，SOD2的mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低缺氧復氧心肌細胞ROS水平，升高SOD2的mRNA和蛋白表達（P＜0.05）；中、高劑量組效應明顯強于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無明顯差異，見表3及圖2。

表2 各組細胞活力和凋亡細胞百分比的比較Table 2.The comparison results of cell viability and percentage of apoptotic cells in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 1.The detection results of apoptosis by flow cytometry.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖1 流式細胞術檢測細胞凋亡

表3 各組細胞miR-432-3p和SOD2的相對表達量及ROS水平Table 3.The relative expression of miR-432-3p and SOD2 and the level of ROS in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 2.The detection results of SOD2 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖2 Western blot檢測SOD2蛋白表達

4 芒果苷對缺氧復氧AC16細胞Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表達的影響

相對于正常組，經缺氧復氧處理后，AC16細胞Bax、caspase-3和caspase-9 mRNA和蛋白表達顯著升高，Bcl-2的mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低AC16細胞Bax、caspase-3和caspase-9 mRNA和蛋白表達，升高Bcl-2的mRNA和蛋白表達（P＜0.05）；中、高劑量組效應明顯強于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間差異無統計學顯著性，見圖3及表4、5。

Figure 3.Detection results of Bax，Bcl-2，caspase-3 and caspase-9 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖3 Western blot檢測Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9的蛋白表達

表4 各組凋亡相關分子mRNA相對表達量的比較Table 4.Comparison of relative mRNA expression levels of apoptosis-related molecules in each group（Mean±SD.n=5）

5 芒果苷抑制缺氧復氧心肌細胞氧化應激反應對Keap-1和Nrf-2表達的影響

缺氧復氧AC16細胞Keap-1的mRNA和蛋白表達無明顯變化，Nrf-2的核轉位明顯增多（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低缺氧復氧AC16細胞Keap-1的mRNA和蛋白表達，促進Nrf-2核轉位（P＜0.05）；中、高劑量組的效應明顯強于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無顯著差異，見表6及圖4。

表5 各組凋亡相關分子蛋白的相對表達量比較Table 5.Comparison of relative protein expression levels of apoptosis-related molecules in each group（Mean±SD.n=5）

表6 各組Nrf-2和Keap-1 mRNA和蛋白相對表達量的比較Table 6.Comparison of relative mRNA and protein expression levels of Nrf-2 and Keap-1 in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 4.Detection results of Nrf-2 and Keap-1 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖4 Western blot檢測Nrf-2和Keap-1蛋白表達

討 論

冠心病、心肌梗死缺血性心臟病發病率近年來逐漸上升，成為了威脅人類健康的主要疾病之一。利用冠脈擴張等方法恢復缺血心肌細胞供血的過程中會導致缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［4］。心肌細胞I/R損傷涉及很多細胞分子機制，包括線粒體損傷、炎癥反應、ROS產生和細胞凋亡等[5]。其中，氧化應激反應在心肌細胞I/R損傷中發揮重要作用，ROS的產生會抑制SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶活性和表達，并且可以修飾細胞內生物分子，產生脂質過氧化、蛋白質變性等變化，給細胞造成一系列不可逆損傷[6]。研究表明，抑制氧化應激反應中ROS的產生可進一步抑制心肌細胞I/R損傷[7]。因此，如何增強機體對氧化應激損傷的抵抗力對于防治心肌細胞I/R損傷至關重要。

心肌細胞I/R損傷引發的氧化應激、線粒體結構功能變化會導致心肌細胞凋亡、壞死。參與調控心肌細胞凋亡的途徑主要有3個：（1）腫瘤壞死因子受體家族介導的死亡受體途徑[8]；（2）促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2調控的線粒體凋亡途徑[9]；（3）受Bcl-2調控，caspase-3、8、9參與的內質網途徑[10]。本實驗結果證明缺氧復氧條件導致心肌細胞促凋亡蛋白Bax上升，抗凋亡蛋白Bcl-2下降，caspase-3和caspase-9表達水平均上升，表明細胞凋亡途徑激活。

芒果苷又名芒果素，是一種四羥基吡酮的碳苷，屬雙苯吡酮類化合物。芒果苷具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用。既往研究顯示芒果苷對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡[11]和柔紅霉素導致的心肌細胞凋亡有抑制作用。體外研究表明芒果苷對A549人類肺癌細胞具有抗腫瘤作用[12]。體外和體內模型試驗證據表明芒果苷作為一種潛在的生物活性劑，可以調節氧化應激相關信號級聯，抑制促炎因子的表達和ROS的生成[13]。本研究的實驗結果表明芒果苷能顯著抑制缺氧復氧造成的心肌細胞凋亡，增強心肌細胞活力，提高細胞抵抗氧化應激損傷的防御能力。

Keap-1/Nrf-2信號通路是細胞內調控SOD、CAT等抗氧化酶的表達和維持氧化/抗氧化平衡的重要通路[14]。Nrf-2屬于CNC調節蛋白家族，廣泛存在于機體各器官，是細胞氧化還原反應的主控調節因子。正常情況下，Nrf-2主要與其抑制劑Keap-1結合，以非活性狀態存在于胞漿中，當細胞受到ROS或其他親核劑刺激后，Nrf-2與Keap-1解偶聯，Nrf-2轉運進入細胞核，激活靶基因表達，調控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉運體的轉錄活性，從而發揮抗氧化損傷作用[15]。最近研究表明，miR-432-3p可直接靶向Keap-1，參與Keap-1/Nrf-2信號通路的調控[16]。本研究發現AC16細胞經缺氧復處理后，Keap-1表達無明顯變化，但Nrf-2核轉位明顯增多，表明缺氧復氧所導致的氧化應激反應，ROS生成增多促進了Nrf-2的核轉位；本研究還發現芒果苷可以升高缺氧復氧AC16細胞的miR-432-3p表達，降低Keap-1的表達，進而促進Nrf-2的核轉位。

綜上所述，芒果苷對缺氧復氧心肌細胞的保護機制可能與提高心肌細胞的抗氧化應激能力進而抑制心肌細胞凋亡有關。Keap-1/Nrf-2信號通路是細胞抗氧化機制的重要途徑，芒果苷對缺氧復氧心肌細胞的保護機制可能與其促進miR-432-3p表達，上調Nrf-2抗氧化應激效應進而保護心肌細胞凋亡有關。本研究深入揭示了芒果苷對缺氧復氧心肌細胞保護效應的分子機制，為防治缺血再灌注心肌損傷提供了新的思路及藥物靶標。