SIRT1/AMPK通路在利拉魯肽早期干預(yù)緩解高脂飲食導(dǎo)致的大鼠非酒精性脂肪性肝病中的作用*

陳 霞，何航輝，蘇 悅，吳宸煒，洪 瑩，莊 飛，王聲遙，徐燕娉，鄭 超

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江溫州325000）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其它明確的肝損害因素導(dǎo)致的、以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪大量沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1］。近年來(lái)，NAFLD的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)［2］。我國(guó)NAFLD的患病率大約為27%，已經(jīng)超過(guò)2型糖尿病11.6%的發(fā)病率，且近年來(lái)有低齡化表現(xiàn)。如何防治NAFLD已成為我國(guó)及全球人口共同面臨的巨大挑戰(zhàn)［3］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，同時(shí)也是機(jī)體重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子［4-5］。有研究顯示SIRT1基因缺失的小鼠與野生型小鼠在相同條件下進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，前者的肝臟脂肪變更加嚴(yán)重，而肝臟過(guò)表達(dá)SIRT1可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島素抵抗［6］。SIRT1下游靶點(diǎn)——AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）［7-10］的激活能通過(guò)調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）等調(diào)控脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子，從而抑制脂肪酸的合成和脂質(zhì)積累［5-6］。利拉魯肽（liraglutide，Lira）是人工合成的胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動(dòng)劑之一，它可以刺激葡萄糖依賴性胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，延遲胃排空，降低食欲，增加β細(xì)胞數(shù)量，從而達(dá)到降低血糖的效果［11-12］，但其在治療NAFLD中的作用還不完全明確。本課題組先前在研究利拉魯肽早期干預(yù)改善肥胖大鼠骨骼肌微循環(huán)并減輕骨骼肌胰島素抵抗的時(shí)候觀察到，用藥組大鼠肝臟的病理學(xué)形態(tài)學(xué)改善明顯，且第172位蘇氨酸磷酸化的AMPK［phosphorylated AMPK at Thr172，p-AMPK（Thr172）］被激活，由此我們?cè)O(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn)，以高脂飲食（high-fat diet，HFD）喂養(yǎng)大鼠18周建立大鼠NAFLD模型，用以探究利拉魯肽早期干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠的影響及SIRT1/AMPK及其下游通路在其中的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠24只，體重（160±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑

含60%脂肪的高脂飼料購(gòu)自江蘇美迪森股份有限公司；利拉魯肽購(gòu)自Novo Nordisk；麻醉藥戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma；兔抗大鼠GLP-1受體抗體購(gòu)自Proteintech。大鼠血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購(gòu)自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠AMPK、p-AMPK（Thr172）、第372位絲氨酸磷酸化的SREBP-1c［phosphorylated SREBP-1c at Ser372，p-SREBP-1c（Ser372）］、第79位絲氨酸磷酸化的ACC［phosphorylated ACC at Ser79，p-ACC（Ser79）］和FAS抗體購(gòu)自CST；兔抗大鼠SIRT1和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）抗體購(gòu)自Aiffinity；兔抗大鼠GAPDH（內(nèi)參照）抗體購(gòu)自杭州至賢生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常飲食（normal diet，ND）組、HFD組和HFD+Lira組，每組各8只。各組大鼠自由飲水進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)在明暗各12 h、22～26℃的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。按不同分組，HFD+Lira組皮下注射利拉魯肽200 μg/kg，每天1次，其余2組皮下注射等體積0.9%氯化鈉注射液。每周記錄進(jìn)食量、體重和血糖，第16周行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（glucose tolerance test，GTT）。第18周末麻醉后行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸動(dòng)脈取血，心臟灌流后處死，取肝臟和皮下、內(nèi)臟及棕色脂肪組織，并稱重。

3.2 GTT 大鼠HFD喂養(yǎng)至第16周進(jìn)行GTT。大鼠過(guò)夜禁食，測(cè)得0 min空腹血糖。事先配制20%的葡萄糖并稱量大鼠體重，按照大鼠每100 g體重1 mL的劑量腹腔注射葡萄糖，隨后分別測(cè)量30、60、90和120 min的血糖水平。

3.3 高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn) 第18周開始，大鼠過(guò)夜禁食，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，使大鼠仰臥于恒溫手術(shù)臺(tái)，迅速完成氣管插管，頸外動(dòng)靜脈置聚乙烯管（PE-50），動(dòng)脈通過(guò)裝有肝素（3×104U/L）生理鹽水的微量注射泵連接血壓儀，監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)；靜脈通過(guò)三通管連接2個(gè)微量注射泵，分別注射30%葡萄糖和胰島30 mU·kg-1·min-1，用強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀每10 min測(cè)定1次頸動(dòng)脈血糖，葡萄糖速率逐漸增加使血糖波動(dòng)在基礎(chǔ)血糖±10%以內(nèi)，最后3次穩(wěn)態(tài)葡糖糖輸注率的均值作為此實(shí)驗(yàn)的葡萄糖輸注率（glucose infusion rate，GIR；mg·kg-1·min-1）。

3.4 HE染色、油紅O染色、馬松染色、天狼星紅染色及ROS熒光染色 取相同部位規(guī)則形狀的肝組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，每組取3個(gè)組織，切成5 μm薄片。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書行HE染色、馬松染色及天狼星紅染色，在熒光正置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。肝組織經(jīng)OCT包埋后，制作冰凍切片，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書行油紅O染色及ROS染色。

3.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片，經(jīng)過(guò)脫蠟，水化以及高壓抗原修復(fù)，PBS洗2次，每次5 min，加3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物，BSA封閉30 min，PBS漂洗后，置于濕盒，分別加入Ⅰ抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，各2分鐘。滴加Ⅱ抗，37℃恒溫箱孵育1 h，PBS漂洗，DAB顯色后，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，然后正置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

3.6 血清 TNF-α、IL-6、TC、TG、ALT和AST測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行以上指標(biāo)的測(cè)定。

3.7 肝組織TC、TG、MDA和SOD測(cè)定 取約30 mg肝臟組織，于300 μL生理鹽水中剪碎并勻漿；離心后取上清到另一離心管內(nèi)。檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

3.8 Western blot 取肝臟組織約30 mg，加入300 μL RIPA裂解液（含100 μmol/L PMSF），用彎眼科剪剪碎組織，使用機(jī)械勻漿機(jī)勻漿后，12 750×g、4℃離心10 min，取上清；采用BCA法測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉封閉1.5 h后加入Ⅰ抗4℃搖床過(guò)夜，用TBST洗膜3次，每次5 min后室溫?fù)u床孵育Ⅱ抗1 h，用ECL法顯影，通過(guò)ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 利拉魯肽降低NAFLD大鼠的體重和肝指數(shù)，減少進(jìn)食量及脂肪積聚

與ND組相比，HFD組大鼠體重、肝指數(shù)及進(jìn)食量顯著升高（P＜0.01），皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪積聚增加（P＜0.05或P＜0.01）；與HFD組相比，HFD+Lira組大鼠體重、肝指數(shù)及進(jìn)食量顯著下降（P＜0.01），皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪含量減少（P＜0.05或P＜0.01）；3組的棕色脂肪含量無(wú)顯著差異，見表1及圖1。

表1 3組大鼠體重、肝濕重、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪及棕色脂肪重量比較結(jié)果Table 1.Body weight，liver wet weight，and the weight of brown adipose tissue（BAT），subcutaneous adipose tissue（SCAT）and visceral adipose tissue（VAT）of the rats in the 3 groups（g.Mean±SD.n=8）

Figure 1.Lira reduced the body wight（A），liver index（B），daily food intake（C）and the ratio of fat weight/body weight（D）of NAFLD rats.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vs ND group；**P＜0.01 vs HFD group.圖1 利拉魯肽降低NAFLD大鼠的體重、肝指數(shù)、每日進(jìn)食量和體脂比例

2 利拉魯肽降低NAFLD大鼠空腹血糖，提高糖耐量及胰島素敏感性

與ND組相比，HFD組大鼠空腹血糖升高（P＜0.05或P＜0.01）；與HFD組相比，HFD+Lira組大鼠空腹血糖下降（P＜0.05或P＜0.01），見表2。GTT結(jié)果顯示，與ND組相比，HFD組大鼠存在糖耐量異常（P＜0.01）；與HFD組相比，HFD+Lira組大鼠糖耐量得到改善（P＜0.01），見圖2A。高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HFD組大鼠GIR為（4.45±0.63）mg·kg-1·min-1，較 ND 組［（11.24±2.15） mg·kg-1·min-1］降 低（P＜0.01），HFD+Lira 組［（8.43±1.42）mg·kg-1·min-1］較HFD組升高（P＜0.05），見圖2B。

表2 3組大鼠第13～18周的空腹血糖水平Table 2.The fasting blood glucose levels of rats in each group in the 13th～18th weeks（mmol/L.Mean±SD.n=8）

Figure 2.Lira improved glucose tolerance and attenuated insulin resitance of NAFLD rats.A：the results of glucose tolerance test；B：the results of hyperinsulinemic euglycemic clamp test.AUC：area under curve；GIR：glucose infusion rate.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vs ND group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs HFD group.圖2 利拉魯肽改善NAFLD大鼠的葡萄糖耐量，減輕胰島素抵抗

3 利拉魯肽降低NAFLD大鼠的血脂，氧化應(yīng)激及炎癥水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與ND組相比，HFD組大鼠血清TG、TC、ALT、AST、IL-6和TNF-α升高，肝組織TG、TC和MDA升高，SOD降低（均P＜0.01）；與HFD組相比，HFD+Lira組大鼠血清TG、TC、ALT、AST、IL-6和TNF-α降低（P＜0.05或P＜0.01），肝組織TG、TC和MDA降低（P＜0.01），SOD升高（P＜0.05），見表3、4。相對(duì)于ND組，HFD組大鼠肝組織ROS熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05或P＜0.01）；與HFD組相比，HFD+Lira組ROS熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

表3 三組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的比較Table 3.The serum related indexes in the rats of each group（Mean±SD.n=8）

表4 3組大鼠肝組織相關(guān)指標(biāo)的比較Table 4.The liver tissue related indexes in the rats of each group（Mean±SD.n=8）

Figure 3.Lira attenuated ROS production in the liver of the NAFLD rats.A：DCFH-DA staining；B：DHE staining.Mean±SD.n=8.#P＜0.05，##P＜0.01 vs ND group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs HFD group.圖3 利拉魯肽減少NAFLD大鼠肝臟ROS的產(chǎn)生

4 利拉魯肽改善NAFLD大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，減輕脂質(zhì)蓄積及纖維化等病理變化

HE染色可見，ND組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯病變，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂質(zhì)沉積；而HFD組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，可見彌漫性肝細(xì)胞大泡或小泡性的脂肪變性；在給予利拉魯肽治療后，肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴減少，且大部分肝細(xì)胞接近正常形態(tài)，見圖4A。油紅O染色結(jié)果顯示，ND組大鼠肝組織無(wú)顯著脂滴沉積，HFD組大鼠肝臟中有大量脂滴沉積，HFD+Lira組大鼠肝組織脂滴沉積較HFD組明顯減少（均P＜0.01），見圖4B。馬松及天狼星紅染色顯示，HFD組膠原纖維較ND組增多，在應(yīng)用利拉魯肽后，膠原纖維較HFD組顯著減少（均P＜0.01），見圖5。

5 利拉魯肽增加NAFLD大鼠肝臟GLP-1受體的表達(dá)

與ND組相比，HFD組大鼠肝臟GLP-1受體表達(dá)降低，應(yīng)用利拉魯肽后GLP-1受體表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01），見圖6。

6 肝臟免疫組化染色顯示利拉魯肽可增加肝臟SIRT1與p-AMPK（Thr172）表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，與ND組相比，HFD組肝臟的SIRT1和p-AMPK（Thr172）表達(dá)量減少，而利拉魯肽治療組肝臟SIRT1與p-AMPK（Thr172）的表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），見圖7。

7 利拉魯肽對(duì)各組大鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白和SIRT1/AMPK通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于ND組，HFD組的SIRT1、p-AMPK（Thr172）、p-SREBP-1c（Ser372）、p-ACC（Ser79）和CPT1A蛋白水平降低（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)AS表達(dá)增加（P＜0.01）；與 HFD 組相比，HFD+Lira組的FAS表達(dá)明顯減少（P＜0.01），SIRT1、p-AMPK（Thr172）、p-SREBP-1c（Ser372）、p-ACC（Ser79）和CPT1A蛋白水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖8。

討 論

Figure 4.Lira attenuated liver tissue structural disorder and lipid accumulation in rats with NAFLD.A：HE staining；B：oil red O staining.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vs ND group；**P＜0.01 vs HFD group.圖4 利拉魯肽減輕NAFLD大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂和脂質(zhì)蓄積

Figure 5.Lira attenuated liver fibrosis of rats with NAFLD.A：Sirius red staining；B：Masson staining.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vsND group；**P＜0.01vsHFD group.圖5 利拉魯肽減輕NAFLD大鼠肝臟纖維化

Figure 6.Lira increased the expression of GLP-1 receptor in the liver of rats with NAFLD（immunofluorescence staining）.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vs ND group；**P＜0.01 vs HFD group.圖6 利拉魯肽增加NAFLD大鼠肝臟GLP-1受體的表達(dá)

Figure 7.Lira stimulated the expression of SIRT1（A）and p-AMPK（Thr172）（B）in the liver of NAFLD rats（immunohistochemical staining）.Mean±SD.n=8.##P＜0.01 vs ND group；**P＜0.01 vs HFD group.圖7 免疫組化染色顯示利拉魯肽可增加NAFLD大鼠肝臟SIRT1與p-AMPK（Thr172）的表達(dá)

Figure 8.Relative protein levels of SIRT1，p-AMPK（Thr172），p-SREBP-1c（Ser372），p-ACC（Ser79），CPT1A and FAS in hepatic tissues of rats in different groups were detected by Western blot.A：Lira increased the protein levels of SIRT1，p-AMPK（Thr172），p-SREBP-1c（Ser372）and p-ACC（Ser79）；B：Lira increased CPT1A expression，but attenuated FAS expression.Mean±SD.n=8.#P＜0.05，##P＜0.01 vs ND group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs HFD group.圖8 Western blot顯示利拉魯肽可增加 NAFLD 大鼠肝臟 SIRT1、p-AMPK（Thr172）、p-SREBP-1c（Ser372）、p-ACC（Ser79）及CPT1A的表達(dá)，減少FAS的表達(dá)

NAFLD是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，但它的發(fā)病原因和機(jī)理尚未完全明確［13-14］。目前，“多重打擊”學(xué)說(shuō)占主導(dǎo)地位。這一學(xué)說(shuō)認(rèn)為：胰島素抵抗和高濃度游離脂肪酸為初次打擊，是NAFLD發(fā)生的必要因素；ROS導(dǎo)致的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及相關(guān)事件為第2次打擊，引起肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)和纖維化；第3次打擊主要是氧化應(yīng)激持續(xù)存在?？梢姡趸瘧?yīng)激是其發(fā)展的關(guān)鍵［15-16］。本研究在結(jié)合“多重打擊”學(xué)說(shuō)及課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用60%的高脂飼料造模，喂養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)大鼠空腹血糖、體重及糖耐量狀態(tài)，大鼠處死前以鉗夾試驗(yàn)評(píng)估大鼠胰島素抵抗情況。后續(xù)研究主要從利拉魯肽減輕脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激、炎癥及纖維化方面展開。結(jié)果顯示，模型組大鼠脂質(zhì)代謝異常，內(nèi)臟和皮下脂肪積聚，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，空腹血糖和攝食量增加，葡萄糖耐量受損，出現(xiàn)胰島素抵抗，這作為“初次打擊”，是NAFLD發(fā)生的源頭。此外，模型組IL-6和TNF-α等炎癥因子水平升高，肝纖維化顯著增加。ROS、SOD和MDA是公認(rèn)的監(jiān)測(cè)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志，而氧化應(yīng)激損傷是NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［13，17］。我們的結(jié)果顯示，模型組MDA和ROS水平升高，SOD水平降低，提示氧化應(yīng)激水平升高，這與該學(xué)說(shuō)提出的“二次打擊”結(jié)論相一致［18］。早期進(jìn)行利拉魯肽治療可控制大鼠食欲，降低體重與空腹血糖，減輕胰島素抵抗、肝臟纖維化、炎癥與氧化應(yīng)激。可見，利拉魯肽對(duì)于NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的“多重打擊”有顯著抑制作用，這可能是利拉魯肽緩解NAFLD的主要機(jī)制。利拉魯肽是一種GLP-1受體激動(dòng)劑，本次研究還檢測(cè)了各組大鼠肝臟GLP-1受體的表達(dá)情況。我們觀察到肝臟組織存在GLP-1受體，且在高脂喂養(yǎng)時(shí)GLP-1受體在肝組織的表達(dá)下調(diào)。機(jī)體在高脂飲食下GLP-1受體發(fā)生下調(diào)，可能是餐后高血糖或者肝臟胰島素抵抗發(fā)生的原因之一［19］。經(jīng)利拉魯肽早期干預(yù)后GLP-1受體表達(dá)量可有所恢復(fù)，這可能是利拉魯肽對(duì)抗NAFLD的另一重要機(jī)制。

近年來(lái)，SIRT1在NAFLD中的作用已成為研究的熱點(diǎn)。SIRT1能顯著降低體內(nèi)ROS的水平并改善氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞的存活狀態(tài)［13］。為了進(jìn)一步探討利拉魯肽緩解NAFLD的機(jī)制，我們研究了它對(duì)SIRT1/AMPK通路的作用。HFD可以降低肝臟SIRT1的表達(dá)，肝內(nèi)過(guò)表達(dá)SIRT1可防止由HFD引起的肝臟脂質(zhì)代謝損傷［20-21］。利拉魯肽緩解NAFLD可能是通過(guò)激活SIRT1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，在HFD導(dǎo)致的NAFLD大鼠中，肝臟SIRT1表達(dá)量下降，而利拉魯肽治療后，SIRT1表達(dá)量顯著升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［22-25］，顯示SIRT1在NAFLD中起調(diào)控作用。SIRT1的下游分子AMPK［26］是廣泛分布于生物體內(nèi)的高度保守的蛋白激酶，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗增殖和抗凋亡等多種生物學(xué)作用，可從多途徑影響脂質(zhì)代謝，包括抑制脂肪酸與甘油三酯的合成，抑制膽固醇的合成、促進(jìn)脂肪酸氧化分解等［27］。在肝臟中，AMPK通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［28-29］。p-AMPK（Thr172）可抑制肝臟脂質(zhì)從頭合成［30］。SREBP-1c、ACC、FAS等是調(diào)控脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子［4］，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在本研究中，HFD導(dǎo)致的NAFLD大鼠肝組織 p-AMPK（Thr172）、p-SREBP-1c（Ser372）及p-ACC（Ser79）蛋白水平降低，F(xiàn)AS表達(dá)量增加；經(jīng)利拉魯肽干預(yù)后ACC等的磷酸化增加，F(xiàn)AS表達(dá)減少。AMPK的Thr172磷酸化激活可導(dǎo)致SREBP-1c的Ser372磷酸化，抑制了核SREBP-1c表達(dá)，降低FAS的表達(dá)，減緩肝臟脂肪變性，而且肝臟激活的p-AMPK（Thr172）可以直接使ACC的Ser79磷酸化而失活［13，29，31］。此外，我們檢測(cè)到 HFD 組肝臟 CPT1A表達(dá)量減少，經(jīng)利拉魯肽早期處理后CPTIA表達(dá)增多。CPT1A是脂肪酸β氧化的限速酶［32-33］，在肝臟的活性較其他組織強(qiáng)，其介導(dǎo)的脂肪酸β氧化是通過(guò)將脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)鏈酯酰CoA催化為長(zhǎng)鏈酯酰肉毒堿，繼而轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，進(jìn)行氧化供能，而ACC可通過(guò)變構(gòu)調(diào)節(jié)抑制CPT1A，從而抑制活性脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化［34］?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果提示利拉魯肽可能通過(guò)激活SIRT1/AMPK通路，調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子，抑制脂肪酸從頭合成，從而在緩解HFD導(dǎo)致的NAFLD中發(fā)揮重要作用，但是更深的機(jī)制需采用SIRT1基因敲除鼠及細(xì)胞或者分子層面的進(jìn)一步研究來(lái)揭示。

綜上所述，利拉魯肽早期干預(yù)可降低血糖，抑制脂肪合成，減輕胰島素抵抗、炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激損傷，從而緩解NAFLD，這可能與SIRT1/AMPK及其下游基因的激活有關(guān)。這一結(jié)果顯示了利拉魯肽作為治療NAFLD潛在藥物以及SIRT1作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性。