宮頸病變患者外周血中TH1/TH2漂移狀態(tài)與T-bet/GATA-3的表達及意義

賽星月 李曉紅 杜蓉

[摘要] 目的 研究宮頸病變患者轉錄因子GATA-3、T-bet與TH細胞因子的相關性及其在外周血中的表達水平及意義。 方法 選擇2017年1月～2019年1月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的76例患者，根據(jù)宮頸液基細胞學檢測分為對照組（33例）、低度鱗狀上皮內病變（L-SIL）組（10例）及高度鱗狀上皮內病變（H-SIL）組（33例）。Rt-PCR檢測血清GATA-3及T-bet表達量，流式細胞學檢測三組血清TH細胞因子含量，相關性分析采用Pearson相關分析。 結果 H-SIL組、L-SIL組白細胞介素（IL）-4、IL-10表達水平高于對照組，GATA-3表達量高于對照組，L-SIL組T-bet表達量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。IFN-γ與T-bet呈正相關（r = 0.65，P < 0.05），與GATA-3呈負相關（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4與GATA-3呈正相關（r = 0.56，P < 0.05），與T-bet呈負相關（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10與T-bet呈負相關（r = -0.65，P < 0.05）。 結論 L-SIL患者的外周血中表現(xiàn)為TH1細胞優(yōu)勢，T-bet的基因表達上調，而H-SIL患者表現(xiàn)為TH2細胞優(yōu)勢，T-bet的基因表達下調。可見，L-SIL、H-SIL的發(fā)生與TH細胞因子、GATA及T-bet具有相關性。

[關鍵詞] 細胞因子;轉錄因子;宮頸病變

[中圖分類號] R737.33 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0076-04

Expression and significance of TH1/TH2 drift and T-bet/GABA-3 in peripheral blood of patients with cervical lesions

SAI Xingyue ? LI xiaohong ? DU Rong

Department of Gynaecology， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830054， China

[Abstract] Objective To study the correction between transcription factors GATA-3，T-bet and TH cytokine in patients with cervical lesions and their expression level and significance in peripheral blood. Methods A total of 76 patients who were admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2017 to January 2019 were selected. According to the cervical thinprep cytologic test， they were divided into control group （33 cases）， low-grade squamous intraepithelial lesion （L-SIL） group （10 cases） and high-grade squamous intraepithelial lesion （H-SIL） group （33 cases）. The expression levels of GATA-3 and T-bet in serum were detected by Rt-PCR， and the TH cytokine levels in serum of three groups were detected by flow cytometry. Pearson correlation analysis was used for correlation analysis. Results The expressions of interleukin （IL）-4 and IL-10 in H-SIL group and L-SIL group were higher than those in control group， and the expression of GATA-3 was higher than that in control group， while the expression of T-bet in L-SIL group was lower than that in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. IFN-γ was positively correlated with T-bet （r = 0.65， P < 0.05）， and negatively correlated with GATA-3 （r = -0.51， P < 0.05）. IL-4 was positively correlated with GATA -3 （r = 0.56， P < 0.05）， and negatively correlated with T-bet （r = -0.72， P < 0.05）. IL-10 was negatively correlated with T-bet （r = -0.65， P < 0.05）. Conclusion Peripheral blood of patients with L-SIL shows dominance of TH1 cells and up-regulated T-bet gene expression， while that of patients of H-SIL shows dominance of TH2 cells and down-regulated T-bet gene expression. It can be seen that the occurrence of L-SIL and H-SIL is related to TH cytokines， GATA and T-bet.

[Key words] Cytokines; Transcription factors; Cervical lesions

我國宮頸癌的病死率居世界第二，從正常宮頸發(fā)展為高度鱗狀上皮內病變（H-SIL）需8～10年，此時機體的免疫狀態(tài)起到關鍵作用[1]，高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導致宮頸癌的主要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，低度鱗狀上皮內病變（L-SIL）患者的T細胞主要為輔助性T細胞1（TH1型），而H-SIL患者主要為輔助性T細胞2（TH2型），宮頸組織中進行免疫調節(jié)的可能是TH1/TH2相關因子。CD4（分化群4）T細胞的表達模式分為TH1型和TH2型，而白細胞介素（IL）-2、IL-12、γ干擾素（IFN-γ）促進TH1型分化，IL-4、IL-10促進TH2型分化[5]，TH細胞分化受多因素調節(jié)，其中GATA-3及T-bet的調節(jié)對TH細胞分化起重要作用，T-bet正調節(jié)TH1型相關因子，GATA-3正調節(jié)TH2型相關因子，所以檢測正常人及宮頸病變患者外周血上述因子的含量及比值，可能發(fā)現(xiàn)TH1/TH2的平衡關系。為明確TH1/TH2與宮頸病變的關系，本研究檢測外周血TH1/TH2含量從而了解不同級別宮頸病變表達水平及差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2019年1月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的76例患者，依據(jù)WHO女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類[6]進行診斷，將經(jīng)宮頸液基細胞學檢測（TCT）結果分為對照組（33例），L-SIL組（10例）及H-SIL組（33例），且L-SIL組與H-SIL組經(jīng)陰道鏡活檢確診。排除受試者未受化療及免疫治療、自身免疫病、血液病、妊娠、過敏等可能影響結果的疾病。

患者均女性，對照組，年齡18～77歲，平均（42.63±14.47）歲;L-SIL組，年齡43～50歲，平均（46.4±2.42）歲;H-SIL組，年齡33～67歲，平均（46.77±10.21）歲。三組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

淋巴細胞分離液（200 mL/瓶，LTS1077）購自天津TBD公司，總RNA提取試劑（Trizol）（100 mL/瓶，15596026）購自Invitrogen公司，T-bet及GATA-3引物序列由華大基因設計合成，SYBR GREEN PCR試劑盒（208054）購自凱杰有限公司，cDNA逆轉錄試劑盒（#K1622）購自Thermo Scientific公司。

1.3 標本的收集與處理

采集受試者空腹血10 mL，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，室溫下以2000 r/min離心20 min獲得單個核細胞層，移入離心管，PBS混勻，洗滌再離心得到單個核細胞，加入1 mL Trizol靜置10 min，-80℃凍存。

1.4 Rt-PCR檢測T-bet和GATA-3 mRNA表達水平

Rt-PCR檢測GATA、T-bet及內參β-actin（各引物序列及擴增長度見表1）。按照說明書提取總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄，結束進行擴增，反應體系按說明配制，擴增條件為：95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 10 s，共35個循環(huán)，循環(huán)后采集擴增曲線生成熔點曲線。記錄循環(huán)閾值（Ct），采用2-△△Ct計算mRNA的相對表達量，其中△Ct=目標基因Ct值-內參β-actin Ct值。每個樣本重復3次，取平均值。

表1 ? 各引物序列及擴增長度

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗;相關性分析采用Pearson相關分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?三組TH細胞因子水平比較

三組TH細胞因子水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。H-SIL組、LSIL組中IL-4、IL-10水平高于對照組，兩組中IFN-γ、IL-2水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）;H-SIL組與L-SIL組TH細胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2 ? 三組TH細胞因子水平比較（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05。L-SIL：低度鱗狀上皮內病變;H-SIL：高度鱗狀上皮內病變;IL：白細胞介素;IFN-γ：γ干擾素

2.2三組T-bet及GATA-3表達量比較

三組T-bet及GATA-3表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。H-SIL組、L-SIL組GATA-3表達量明顯高于對照組，L-SIL組T-bet表達量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。L-SIL組與H-SIL組T-bet及GATA-3表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

表3 ? 三組T-bet及GATA-3表達量比較（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05。L-SIL：低度鱗狀上皮內病變;H-SIL：高度鱗狀上皮內病變

2.3 相關性分析結果

IFN-γ與T-bet呈正相關（r = 0.65，P < 0.05），與GATA-3呈負相關（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4與GATA-3呈正相關（r = 0.56，P < 0.05），與T-bet呈負相關（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10與T-bet呈負相關（r = -0.65，P < 0.05）。見圖1。

3 討論

細胞因子、胞內信號傳導通路和核轉錄因子這三個環(huán)節(jié)是近代免疫學調控TH1/TH2的重要環(huán)節(jié)[7]，免疫調節(jié)在很多腫瘤的發(fā)展中起決定性作用[8-10]，HPV感染有自限性，可通過免疫調節(jié)控制HPV持續(xù)性感染[11]。研究顯示[12]，抗腫瘤作用依賴TH1型細胞，TH1型細胞分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子[13];判斷宮頸癌重要指標為IFN-γ[14]，可見細胞因子與宮頸病變密切相關;TH2型細胞為IL-4、IL-10等[15]。IL-10水平上升不利于機體抗腫瘤作用，實驗顯示[17]，IL-10水平升高可作為評估腫瘤進展的標志。本研究結果顯示，H-SIL組IL-10水平高于對照組，呈向TH2漂移狀態(tài);IFN-γ水平低于對照組，呈向TH1偏移狀態(tài)，提示TH1/TH2平衡狀態(tài)的改變與宮頸病變的發(fā)展有密切的聯(lián)系，這與李鋒等[12]研究相符。可見TH細胞因子間的平衡關系與宮頸病變發(fā)展存在一定關系。

T-bet與GATA-3是調節(jié)平衡的重要因子，本研究結果顯示，H-SIL組GATA-3表達量高于對照組，T-bet表達量低于對照組。可見隨宮頸病變程度加重，GATA-3含量也有上升趨勢。相關研究發(fā)現(xiàn)[18]，T-bet正調節(jié)TH1型細胞因子，GATA-3正調節(jié)TH2型細胞因子，TH1型特異轉錄因子為T-bet，促進IFN-γ表達及TH1細胞因子分化;而TH2型特異轉錄因子為GATA-3，促進TH2型細胞因子的表達[19]。本研究結果顯示，TH1型細胞因子與T-bet表達正相關，TH2型細胞因子與T-bet負相關，故推測T-bet/GATA-3與TH1/TH2的平衡有關，這在食管癌相關研究中也有體現(xiàn)[20]。

綜上所述，可通過檢測相關細胞因子含量了解患者的免疫狀態(tài)，也可將轉錄因子T-bet及GATA-3做為靶點，使TH1及TH2維持在平衡狀態(tài)，從而逆轉腫瘤的發(fā)生。

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（收稿日期：2019-10-17 ?本文編輯：劉明玉）