梨休眠芽超低溫保存研究

王云瓊?楊朝應

摘 要：本次實驗以梨休眠芽為材料研究了干燥時間、預處理時間、PVS2裝載時間及解凍方式對超低溫保存后梨休眠芽再生率的影響。結果表明，休眠芽干燥12h，先用60%PVS2預處理20min，再用100%PVS2處理20min，取出后用43℃水浴解凍3min，然后用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗，接種在再生培養基試管中，進行光照培養，可獲得較高的萌發率。相同條件下用43℃水浴解凍比流水解凍好。

關鍵詞：梨休眠芽;超低溫保存

莖尖分生組織超低溫（-196℃）保存技術是種質資源長期保存的理想技術，它既實現了對種質資源的長期保存，同時可以快速進行無性繁殖，減少了材料的遺傳變異性。近年來隨著國內外對超低溫保存研究的不斷發展，逐步發展有干凍法、預培養法、玻璃化法、包埋脫水法等超低溫保存技術。到目前為止，采用超低溫保存技術已經在蘋果、扁桃等近千種植物材料成功進行了超低溫保存，超低溫保存休眠芽的效果往往比其他組織器官還好，而且容易通過叢生芽途徑再生植株。本試驗擬對以梨休眠芽為外植體的超低溫保存進行研究，找出有利于梨休眠芽超低溫保存的最優方案，為梨在林業中的應用以及梨樹種質資源的長期保存提供支撐。

一、材料與方法

（一）實驗材料

本實驗材料采集時間為2018年11月中旬。長度約10cm帶休眠芽的枝條若干枝，取回實驗室立即進行實驗處理。

（二）實驗方法

1.梨休眠芽外植體滅菌。將休眠芽帶一點木質部切下，剝去1～2層鱗片放入燒杯，用流水沖洗干凈后轉移到小錐形瓶中，加75%酒精清洗2次，再加無菌水清洗，而后加0.1%升汞，滴1滴吐溫-80，蓋上蓋子浸泡3min倒掉，而后加入無菌水清洗5次，時間分別30s，3min，3min，5min，3min。然后開始剝芽2mm左右，放入培養皿中待用。

2.培養基的配制及滅菌。將各種器皿洗凈放在指定位置。首先用量筒量取所需的母液按順序加入1000mL搪瓷杯中攪拌，然后加入1.5mg/L6-BA和0.5mg/LIBA，加入稱取的蔗糖和適量無菌水并不斷攪拌至溶解，加水定容到1000mL，用氫氧化鈉或稀鹽酸pH調值為6.0。加入瓊脂，在電磁爐上加熱攪拌使其完全溶解。然后將培養基分裝到三角瓶中并封好瓶口，放入高壓滅菌鍋滅菌中（氣壓121℃，時間18min）滅菌。滅好菌后取出培養基，用注射器加入0.5mg/LGA到三角瓶中，攪拌并分裝到已滅好菌的平底試管中，平放凝固后接種用。

3.實驗處理與再生。本實驗通過干燥時間、預處理時間、PVS2處理時間、解凍方式等4個維度進行對照試驗，每1個處理重復3次，每個重復含10個休眠芽。經過干燥、預處理、PVS2處理、解凍等處理過程，最后將處理后的材料用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗2次，然后進行恢復培養，每1個莖尖單獨接種于含有MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉培養基的平底試管中，光照培養溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx的條件下進行，光照時間14h/d，30d后統計數據。

二、結果與分析

（一）干燥時間對超低溫保存的影響

從表1可知，不經過干燥和干燥8h的芽全部被污染，萌發率都為0.00±0.00b。干燥12、16、20h休眠芽都有一定的萌發率，隨著干燥時間延長，休眠芽的萌發率也開始逐漸降低，到20h的時候，萌發率只有43.33±0.15a。干燥時間長短對休眠芽超低溫保存后萌發率有一定的影響。干燥12h梨樹休眠芽萌發率最高，為60.00±0.17a。由此可以得出干燥12h為梨休眠芽萌發的最佳時間。

（二）預處理時間對超低溫保存的影響

從表2可以看出，以干燥20h的休眠芽為材料進行預處理，預處理10min，萌芽率最高，可達到56.67±0.05a，不經過預處理和預處理20min的萌芽率都低于預處理10min的萌芽率相同，經過預處理10min的休眠芽恢復培養后植株生長勢良好。由此得出，同等條件下預處理10min對梨休眠芽萌發最佳。

（三）PVS2處理時間對超低溫保存的影響

從表3可以得出，同樣以干燥20h的休眠芽為材料，不經過PVS2處理萌發率可到達46.67±0.11a，處理10min和處理20min的污染率更高，PVS2處理時間過長，對休眠芽有一定的傷害，導致萌芽率的降低。

（四）不同解凍方式對超低溫保存的影響

從表4可知，水浴解凍方式萌芽率可達到43.33±0.12，而相同條件下流水解凍方式的萌芽率只有36.67±0.23，由此的出，對于梨休眠芽超低溫保存的萌發率來說，水浴解凍方式優于流水解凍的方式。

三、討論

適當的干燥時間對梨休眠芽超低溫保存后休眠芽的萌發率有一定的提高。含水量的多少直接影響超低溫保存是實現超低溫保存的關鍵，不同植物的超低溫保存適宜含水量不同。本實驗主要是探討干燥時間對梨休眠芽萌發率的影響，通過本次實驗研究得梨休眠芽最佳干燥時間為12h，萌發率為60%。預處理時間對梨休眠芽超低溫保存后的萌發率有不同程度的影響，通過實驗分析，60%PVS2預處理和PVS2同時處理20min，梨休眠芽的萌發率可到60%。

解凍方式的不同對超低溫保存后梨休眠芽的萌發也有一定的影響，本實驗經分析得出，相同條件下水浴解凍后梨休眠芽的萌發率高于流水解凍的萌發率，得出水浴解凍方式優于流水。

梨休眠芽經過超低溫保存的萌發率高，而且再生植株的遺傳性也很穩定，生長勢良好，因此可以作為一種長久有效保存休眠芽的方法。

參考文獻：

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