葡萄中酵母菌的篩選及菌株鑒定

馮炘

摘要：以葡萄為菌源，分別在葡萄發酵的前期、中期、后期取一定的發酵液進行稀釋涂布，后經過YPD培養基對涂布后的菌株進行分離純化。將分離純化后的菌株進行WL培養基聚類分析及生理生化實驗，并用TTC培養基對菌株進行初篩，選取紅色最深的菌株作為復篩菌株。對復篩菌株進行發酵性能測定篩出發酵性能較好菌株，編號為Y1，并對此菌株進行分子生物學鑒定。Y1菌株的26S r DNA鑒定結果表明其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），此菌株為后續發酵實驗提供了基礎。

Abstract： With grape as the source of bacteria， a certain fermentation broth was diluted and coated in the early， middle， and late stages of grape fermentation， and the coated strain was separated and purified by YPD medium. The isolated and purified strains were subjected to WL culture cluster analysis and physiological and biochemical experiments， and the strains were pre-screened with TTC medium. The reddest strain was selected as the re-screening strain. The fermentation performance of the double-screened strain was determined， and the strain with better fermentation performance was screened out， and the number was Y1， and molecular biology identification was performed on the strain. The 26S r DNA identification of Y1 strain showed that it was Saccharomyces cerevisiae， which provided a basis for subsequent fermentation experiments.

關鍵詞：酵母菌;分離鑒定;發酵特性;生理生化

0? 引言

酵母菌是一類被廣泛應用在發酵工業中的單細胞真菌，它廣泛分布在自然界各處[1]。酵母菌是以芽孢繁殖為主的單細胞真核微生物，大部分的酵母菌是腐生的，生活在含糖量較高、偏酸性的環境中，如生長在花朵、植物果實表面等，還有很大一部分生活在蔬菜園、水果園園的土壤中;小部分為寄生的[2，3]。酵母菌的生長繁殖速度較快、也比較容易分離純化。酵母常用于釀酒、食品制作等，是人類最早應用于生活的微生物之一。隨著人們對酵母菌研究的逐步深入，酵母菌也逐漸被應用在酶制劑、物料生產、醫藥工業以及環境保護等各個方面。

目前，酵母菌主要應用在構建基因工程菌、釀酒及其他發酵產業。釀酒酵母可以發酵不同來源的植物碳水化合物，例如：水果汁等。葡萄果實甜度高、顆粒飽滿、營養豐富，適合微生物的生長繁殖，酵母菌在有氧和無氧的環境中都能生長，即酵母菌是兼性厭氧菌，在有氧的情況下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生長較快;在缺氧條件下，細胞進行無氧酵解，在酶的作用下，葡萄糖代謝為丙酮酸，丙酮酸在無氧條件下，在細胞內丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶作用下，生成乙醇和二氧化碳[4-6]。

微生物菌株是生產乙醇的主力軍，在以木質纖維素為原材料的發酵生產乙醇的工藝中，酵母菌的篩選顯得格外重要[7-10]。本文以葡萄為菌源，通過稀釋涂布、YPD分離純化、WL培養基聚類分析、生理生化、TTC培養基初篩及菌株發酵性能測定得到發酵性能較高的菌株，為之后課題組對秸稈發酵液產乙醇的工藝提供了基礎。

1? 材料與方法

1.1 培養基與試劑

1.1.1 培養基

YPD培養基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，瓊脂粉25g，蒸餾水1000mL，pH自然，115℃滅菌20min。

TTC培養基：上層：葡萄糖5g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑0.5g，瓊脂15g、蒸餾水1000mL;下層：YPD瓊脂培養基，121℃滅菌 20min。

WL培養基：葡萄糖50g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，氯化鉀0.425g，磷酸二氫鉀0.55g，氯化鈣0.125g，氯化鐵0.0025g，硫酸錳0.0025g，硫酸鎂0.125g，溴甲酚綠0.022g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH 5.5，121℃滅菌20min。

活化培養基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸餾水1000mL，pH自然，115℃滅菌20min。

發酵培養基：葡萄糖40g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸餾水1000mL，pH5.0，115℃滅菌20min。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，瓊脂粉，2，3，5-三苯基氯化四氮唑，溴甲酚綠，KH2PO4，KCL，CaCL2，MgSO4，FeCL3，MnSO4，NaNO3，NaCL，CaCO3等均為分析純。

1.1.3 菌株來源

本研究的菌株分離自葡萄自然發酵的前期、中期和后期。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

稱50g新鮮成熟度好的葡萄，搗碎，放入50mL已滅菌的蒸餾水中，30℃靜置培養。分別于發酵的初、中、后期取一定濃度的發酵汁0.1mL，梯度稀釋至10-7倍均勻涂布于YPD瓊脂培養基，27℃培養48h。隨機挑取15-20個單菌落，以劃線方式在YPD平板上分離純化。此過程重復3-5次。菌株于4℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的WL聚類分析

將分離菌株劃線接種于WL培養基上，28℃恒溫培養箱培養24h，觀察菌落形態及顏色，可對照《酵母菌的特征及鑒定手冊》對菌株進行初步分類鑒定[11]。

1.2.3 菌株的生理生化實驗

根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》可知，酵母菌的生理生化實驗主要包括：氮源同化、碳源同化以及糖發酵實驗 [12]。

1.2.4 TTC篩選法

將保藏的酵母菌株用YPD液體培養基活化后，一一對應涂布于 TTC 底層培養基上，在28 ℃恒溫箱中培養 48 h。待滅菌后的上層培養基已冷卻為 45～50℃時倒在底層培養基上，于 30℃無光條件下培養2-4h 后，取出立即觀色，根據菌落呈色情況挑選菌種。

1.2.5 酵母菌發酵性能測定

酵母菌在無氧條件下通過呼吸作用，將糖類轉化為乙醇，并放出二氧化碳，以上過程可表示為C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。由此式可知，通過CO2產生的量可以對菌種的發酵能力進行推斷，繼而表征發酵效率[13]。

配制100mL YPD發酵培養基，按 10%的接種量接入種子液，同時將未接種的發酵培養基作為對照，稱重后放入培養條件為28℃、120r/min的搖床培養箱中，發酵過程中每隔12h 取出稱重，直至發酵液前后質量差與對照組質量差相當，即認為發酵終止。計算排氣前后重量差，即 CO2釋放量。

1.2.6 菌株的分子生物學鑒定

將菌種送寶生物工程（大連）有限公司進行26s rDNA區擴增及序列測定[14-16]。根據測序結果，通過NCBI核酸序列數據庫中BLAST進行相關序列搜索進行同源序列搜索，比較測序菌株與已知酵母菌相應序列的相似程度 [17]。

2? 結果與分析

2.1 分離純化結果

通過數代的分離純化，共獲得能在YPD培養基上良好生長的菌株9株將其統一編號為C1-C9，酵母菌形態描述見表1。

2.2 鏡檢結果

將菌株一一對應制作成水玻片，再將制好的裝片放在顯微鏡下進行觀察，由低倍鏡到高倍鏡， 鏡檢結果描述見表2。

由表2可知：初篩得到的菌株細胞形態大多為橢圓形或圓形，另外還有少數呈檸檬形，皆為多端出芽的無性繁殖，無假菌絲出現且有子囊孢子。

2.3 WL培養基聚類

生長于WL培養基上的酵母菌的菌落形態和顏色會因為種類不同而出現較明顯的區別[18]。WL培養基菌落形態見表3。

依據表3的菌落顏色及形態與《酵母菌：特征與鑒定》第三版中的菌株特征對照，初步鑒定出C1為中間型酒香酵，C2為葡萄汁有孢漢遜酵母，C3、C6、C8為釀酒酵母菌，C4為戴爾有孢圓酵母[19，20]。剩余菌株暫無鑒定結果。

2.4 生理生化分析

由表4可知，9株菌都可以利用葡萄糖進行發酵，幾乎不能利用阿拉伯糖和木糖進行發酵。至于其它幾種糖，分別呈陽性、弱陽性、陰性。

由表5可知，9株菌株均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖為碳源的液體培養基中生長，呈陽性;至于乳糖、阿拉伯糖、木糖則呈陽性、弱陽性、陰性等。

由表6可看出，這9株不同菌株都可以在以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨或尿素的培養基上生長，且生長狀況良好，呈陽性。

2.5 TTC篩選結果

TTC平板顯色結果如圖1所示。

比較圖1中的顯色結果可知，C2、C5、C7培養基中菌落呈現深紅色，其余的則偏粉紅色和淺白色。將顯色反應更為明顯即顯色后顏色更為深紅的菌株劃線分離后并將其分別重新編號得到Y1、Y2、Y3，篩得的3株菌株即為發酵產乙醇能力較強的菌株。

2.6 CO2釋放量測定

由圖2可知，3株酵母菌的CO2釋放量均隨著發酵時間的增加而逐漸減少，即在發酵過程的前24h時，發酵效率最大，隨后產生的 CO2含量減少，即單位時間發酵產生的乙醇含量減少。因此前24h的CO2釋放量作為發酵效率高低的比較指標。圖中Y1在24h時的CO2釋放量明顯高于其它兩株菌，初步推斷Y1菌株的發酵效率高于其它兩株。

2.7 分子生物學鑒定結果

使用MEGA-X 軟件進行多序列對位排列，并采用N-J方法構建系統發育樹，分離菌株Y1與標準菌株Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632的同源性超過99%，表明其具有較近的親緣性。菌株Y1鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3? 結論

通過YPD培養基分離純化出9株酵母菌，分別編號為C1-C9。對9株酵母菌進行碳源同化、氮源同化和糖發酵實驗。結果表明，9株酵母菌都可以利用葡萄糖進行發酵，幾乎不能利用阿拉伯糖和木糖進行發酵，且均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖為碳源的液體培養基和以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨或尿素的培養基上生長，生長狀況良好，呈陽性。

通過WL培養基聚類分析初步判斷C3、C6、C8為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、C4為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora debrueckii）、C2為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），其它菌株暫無分類結果。通過TTC培養基篩選出3株乙醇高產菌株，重新命名為Y1、Y2、Y3。通過CO2釋放量測定表明Y1的發酵性能最。通過對Y1菌株的分子生物學鑒定表明，分離菌株Y1與標準菌株的同源性超過99%，表明其具有較近的親緣性，菌株Y1鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

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