“女貞子-墨旱蓮”藥對主要活性成分的網絡藥理學研究

吉秀家 王艷波 李芳

[摘要]目的 運用網絡藥理學方法探討“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要活性成分、靶點，初步研究其藥理學作用機制，為進一步深入探討其藥理學作用提供新線索。方法 通過文獻挖掘及檢索數據庫的方法篩選出“女貞子-墨旱蓮”的主要活性成分、靶點，構建成分-靶點數據庫，導入Cytoscape軟件構建網絡，獲取靶點信息。篩選出關鍵靶點，利用metascape系統進行富集和通路分析。結果 經篩選得到“女貞子-墨旱蓮”有活性成分24個，共248個靶點，主要涉及體液調節、對氧反應、細胞凋亡、神經受體相互作用等生物學過程中的多條信號通路。結論 網絡藥理學方法初步揭示了“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要藥理學機制。

[關鍵詞]網絡藥理學;女貞子;墨旱蓮;活性成分

[Abstract] Objective To explore the main active ingredients and targets of the ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″? drug pair using the network pharmacology method， so as to study the mechanism of pharmacological action， and provide a new clue for further in-depth study of its pharmacological effect. Methods By searching the TCMSP database， combined the oral bioavailability and chemochemical property analysis， the effective components and target information of limond-inkwort were screened， and Cytoscape software was used to construct the component-target network to obtain the target information. Metascape system was used to annotate and analyze gene function and pathway. Results A total of 24 candidate active molecules were screened from the ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″ drug pair， acting on 248 targets， mainly involving multiple signaling pathways in biological processes such as humoral regulation， oxygen response， cell apoptosis， and neural receptor interaction. Conclusion Network pharmacology method reveales the main pharmacological mechanism of ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″ drug pair.

[Key words] Network pharmacology; Fructus Ligustri Lucidi; Ecliptae Herba; Active ingredient

二至丸（Erzhiwan，EZW）是由女貞子、墨旱蓮組成的我國的經典名方，出自清代《醫方集解》，兩者均歸肝腎經，具有補益肝腎、滋陰養血的功效，常用于肝腎陰虛、腰膝酸軟、頭暈耳鳴等證[1-3]。現代藥理研究結果顯示，二至丸具有抗氧化、抗惡性腫瘤、抗炎、改善血流變及調節免疫等諸多功效[4]。目前大部分研究主要針對藥物對個體或個別分子的研究，但如何從整個分子層面上對女貞子-墨旱蓮的作用機制、組方依據進行研究，目前尚不明確。

網絡藥理學（network pharmacology）是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡的基礎上，通過網絡分析，系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，揭示多分子藥物協同作用的特點[5]。采用系統藥理學技術，識別中藥活性物質、確定活性物質的作用靶點，并運用網絡分析方法建立藥物分子、靶點、細胞、組織、器官之間的相互作用網絡，明確藥效物質和疾病的關系，借以闡明和預測中藥療效和毒性。本研究嘗試用網絡藥理學的方法構建“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要活性物質、靶點的網絡模型，以期為闡明“女貞子-墨旱蓮”藥對的藥理作用機制提供參考。

1資料與方法

1.1藥物活性成分及靶標的獲取

利用中藥網絡藥理學數據及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）收集女貞子、墨旱蓮的所有化學成分。考慮到藥物進入體內不可能全部吸收，故將篩選條件限定為：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性指數（drug like index，DL）≥0.1。然后根據各個成分的ADME性質遴選出女貞子-墨旱蓮的活性成分及其對應的候選靶標。由于檢索到的藥物靶標命名不太規范，故使用UniProt蛋白數據庫（http：//www.uniprot.org）中的UniProtKB功能，輸入靶點名稱并將物種設定為人，檢索到靶標的蛋白名稱。

1.2活性成分-靶點的網絡構建

將收集到的女貞子、墨旱蓮的候選化合物與潛在的靶點利用Cytoscape3.7.0軟件構建出該藥對“活性成分-靶點”相互作用網絡模型。運用Network Analyzer插件進行網絡特征的分析。

1.3生物學過程及通路分析

將女貞子、墨旱蓮的靶標蛋白導入到metascape軟件（http：//metascape.org），得到相應基因列表;然后對基因列表進行富集分析及通路分析。

2結果

2.1“女貞子-墨旱蓮”藥對中的候選活性成分分析

篩選后得到女貞子活性成分18個，墨旱蓮活性成分13個，共29個（含有2個共同成分）候選化合物，其中有5個未找到靶標，剩余24個找到靶標248個，11個無人類基因，最終獲得靶標237個。女貞子篩選后的成分主要以長蒴黃麻苷（苷元）（olitoriside_qt）、圣草酚（eriodictyol）、金吉苷（苷元）（kingiside_qt）等為主;墨旱蓮主要含（Z）-1-（2，4 -二羥基苯基）3-3，4-二羥基苯基prop-2-en-1-1[（Z）-1-（2，4-dihydroxyphenyl）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）prop-2-en-1-1]、去甲蟛蜞菊內酯（demethylwedelolactone）、漆黃素（butin）等為主（表1）。

2.2“活性成分-靶標”網絡分析

通過Cytoscape3.7.0軟件繪制出“女貞子-墨旱蓮”藥對的“活性成分-靶點”相互作用網絡圖（圖1）。共包括261個節點和495條邊，每條邊代表靶標與活性成分之間的相互關系。261個節點中包括24個化學成分和248個潛在作用靶標。其中每個活性成分平均作用于20.63（495/24）個靶標，每個靶標鏈接藥物數量平均為2.00（495/248），反映出女貞子-墨旱蓮藥對發揮藥效的過程是以多途徑、多環節、多靶標、整體協同的方式完成的。

結果顯示，擁有最多潛在靶標的是槲皮素（quercetin），共135個;其次是山萘酚（kaempferol），包含62個;木犀草素（luteolin）含57個，β-谷固醇（β-sitosterol）含37個潛在靶標。這幾個化合物可能在女貞子-墨旱蓮藥對的藥理過程中起關鍵作用。研究顯示，槲皮素、山奈酚、木犀草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、抗炎及調節免疫保護神經等多種藥理作用[6-9]。β-谷固醇是一種植物固醇，具有較好的降血脂作用[10]。另外，結果顯示，靶點括前列腺素G/H合酶（2PTGS2）、熱休克蛋90AB1（HSP90AB1）、核受體輔激活蛋白2（NCOA2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）擁有最多的配體。研究顯示，PTGS2主要參與癌癥[11]、炎癥反應[12]以及心血管疾病，如動脈粥樣硬化、血栓性疾病[13]等多種病理過程;HSP90可以抑制肺腺癌細胞[14]遷移、增殖，誘導肺腺癌細胞凋亡，并且可以增加肺腺癌細胞體外放射敏感性[15];NCOA2對脂肪沉積有著重要的調控作用[16];PTGS1主要被認為參與細胞間信號傳導和維持組織體內平衡。因此，可推測“女貞子-墨旱蓮”藥對主要在炎性反應、抗腫瘤等領域發揮較好的生物學活性。

2.3靶標的富集及通路分析

運用metascap軟件對潛在的靶標進行生物學分析。結果顯示，“女貞子-墨旱蓮”藥對的靶標基因主要富集在1123個生物學過程。主要富集過程包括：對無機物的反應（response to inorganic substance）、調節體液水平（regulation of body fluid levels）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、細胞對氮化合物的反應（cellular response to nitrogen compound）、氧水平反應（response to oxygen levels）、對營養水平的反應（response to nutrient levels）、細胞遷移的正調控（positive regulation of cell migration）、上皮細胞凋亡過程（epithelial cell apoptotic process）、血液循環（blood circulation）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、腺發育（gland development）等（圖2，見封四）。

通路分析結果共得到信號通路228條，顯著性較高的通路如下：白細胞介素信號（signaling by interleukins）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥通路（pathways in cancer）、糖尿病并發癥AGR受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）等（表2）。

3討論

中醫“同病異治，異病同治”的整體觀念，為通過網絡藥理學的方法研究中藥提供了新思路。中醫治療主要基于整體觀念的思維模式，實現多維調控的復雜理論體系，這與網絡藥理學基于多靶點的研究策略十分相似。因此，通過“靶點-藥物-疾病”相互作用網絡去分析中藥活性成分的藥理機制，找到疾病新靶點的概率可能會增加[17]。

本研究結果從“女貞子-墨旱蓮”藥對中篩選出候選活性分子24個，預測出248個相應的靶點。通過構建活性成分和靶點網絡模型并分析結果發現度值較高的候選活性分子分別是槲皮素、山萘酚、木犀草素、β-谷固醇，度值較高的靶點蛋白為PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PTGS1，這些活性成分和靶點可能是藥對中發揮關鍵作用的物質。通過富集分析和通路分析得出藥對中活性成分的靶點主要參與的生物過程包括體液調節、對氧反應、細胞凋亡、神經受體相互作用等，主要在調控腫瘤、炎癥與免疫相關類通路發揮其藥理作用。本研究結果顯示，二至丸可以作用于多個靶點，發揮多種治療作用，尤其是對腫瘤性疾病。周步高等[18]的研究結果顯示，二至丸防治腫瘤機制與其調節腫瘤免疫逃逸和免疫編輯等作用相關。