薄膜分散法制備美洲大蠊提取物脂質體工藝研究

于永杰，顏寅萍，王旭，吳俊珠

（云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室（大理大學）,大理大學藥學與化學學院，云南 大理）

0 引言

美洲大蠊為節肢動物門昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，民間俗稱“蟑螂”，入藥始載于《神農本草經》[1]。美洲大蠊提取物中所含的化學成分主要有尿嘧啶等核苷類、氨基酸類、多糖類、多肽等[2]。現代藥理研究表明，美洲大蠊提取物具有促進組織修復、抗肝纖維化、提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗炎鎮痛、改善微循環等作用[3]。近年來，對美洲大蠊提取物的研究和利用越來越多，上市制劑有康復新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊、消癥益肝片等[4]。目前美洲大蠊提取物的劑型有膠囊、片劑、凝膠劑、軟膏劑等劑型[5-6]，關于美洲大蠊提取物脂質體的研究尚未見報道。脂質體是將藥物包封于類脂雙分子層中的超微型囊泡狀藥物載體，能夠提高美洲大蠊提取物的滯留時間、增加病灶部位靶向性及掩蓋藥物的不良味道[7-8]，本課題制備美洲大蠊提取物脂質體，以包封率為指標，通過正交實驗優選處方及制備工藝，并考察最優工藝脂質體的外觀、Zeta 電位、粒徑等指標，為美洲大蠊提取物脂質體的制備和應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP224C 型分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（G1315D 型DAD 檢測器）；RE-2000 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-20B 型數顯高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Tecnai-G20 型透射電鏡（美國FEI 公司）；ZS90 型納米粒徑電位分析儀（英國Malvern 公司）。

1.2 藥物與試劑

美洲大蠊提取物（云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室大理大學劉光明教授提供）；尿嘧啶（中國食品藥品檢定研究院，批號100469-201302）；大豆卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司）；膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司）；三氯甲烷（天津利安隆博華醫藥化學有限公司）；葡聚糖凝膠G-50（上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 美洲大蠊提取物脂質體的制備

分別稱取適量大豆卵磷脂和膽固醇，置于茄型瓶中，用適量三氯甲烷使其充分溶解，減壓抽濾旋轉蒸發除去三氯甲烷，在瓶壁上形成均勻類脂薄膜。稱取適量美洲大蠊提取物浸膏，用pH6.6 磷酸鹽緩沖液( PBS)配成溶液，倒入上述茄形瓶10mL 含藥PBS，常壓旋轉水化1.5h，經f0.45μm 微孔濾膜過濾，即得脂質體混懸液。

2.2 脂質體中指標成分含量測定

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBOX SB-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長254nm，流動相：水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～2min，2%B；2～16min，7.3%B；16～20min，8%B；20～25min，2%B），流 速0.6mL·min-1，進樣量20μL，柱溫25℃。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密吸取美洲大蠊提取物脂質體0.5mL 至10mL 容量瓶，用適量甲醇破乳，超聲15min 后用pH6.6 PBS 定容，f0.22μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。于4℃保存，備用。

2.2.3 對照品溶液的制備

精密量取尿嘧啶標準品適量至容量瓶，超聲溶解后用pH6.6 PBS 定容，即得。

2.2.4 專屬性實驗

取對照品與空白脂質體混合溶液，對照品溶液，空白脂質體溶液用適量甲醇處理后進樣，結果證明脂質體輔料對含量測定無干擾。結果如圖1。

2.2.5 標準曲線的建立

精密稱取尿嘧啶標準品1.60mg，置于100mL 容量瓶中，用pH6.6 PBS 溶解，超聲，待尿嘧啶完全溶解后定容，得16μg·mL-1貯備液，精密量取貯備液稀釋成質量濃度分別為0.25，0.5，1，2，4，8，16μg·mL-1的系列標準溶液，按照2.2.1 項下色譜條件進行操作，測定色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=128.29X-12.193（R2=0.9999），尿嘧啶在0.25～16μg·mL-1范圍內線性良好。

圖1 專屬性實驗HPLC 色譜圖

2.2.6 精密度實驗

取對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，以尿嘧啶峰面積進行計算，RSD 為0.16%，表明儀器的精密度良好。

2.2.7 穩定性實驗

取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h 依次進樣，以尿嘧啶峰面積進行計算，RSD 為1.6%，表明在12h 內供試品溶液穩定性良好。

2.2.8 重復性實驗

平行制備6 份供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別進樣6次，以尿嘧啶峰面積進行計算，RSD 為1.78%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率實驗

精密吸取0.5mL 空白脂質體至10mL 容量瓶中，分別精密量取0.8、1.0、1.2mL 的16μg·mL-1的尿嘧啶對照品溶液，各平行3份，加入適量甲醇破乳，超聲混勻后用PBS 定容至刻度，過濾后按2.2.1 項下色譜條件進樣，得平均回收率為99.15%，RSD 為0.94%，表明此方法的加樣回收率良好，結果見表1。

表1 加樣回收實驗結果（n=9）

2.3 微柱離心法測定美洲大蠊提取物脂質體的包封率

2.3.1 微柱的制備

取2.5mL 一次性注射器，將濾紙置于針筒管底防漏，然后倒入充分溶脹且除去氣泡的葡聚糖凝膠G-50，4000r·min-1離心3min，除去多余PBS，即得微型柱，所得柱床高度與2.5mL 刻度線相平。

2.3.2 微柱離心法的洗脫條件

通過預實驗，最終洗脫條件為：取0.5mL 脂質體混懸液緩慢添加于微柱的柱床上，4000r·min-1離心3min，得第一次濾液。然后加入0.5mL PBS，4000r·min-1離心3min，得第二次濾液。重復此操作三次，最后將以上五次濾液收集待測。

2.3.3 柱回收率實驗

精密吸取空白脂質體0.5mL，緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項下條件洗脫，將收集的濾液入10mL 容量瓶，用PBS 定容。以PBS 為空白對照，用紫外分光光度計檢測500nm 波長處的吸光度（A1），另精密吸取空白脂質體0.5mL 入10mL 容量瓶，用PBS定容。同法測定500nm 波長處的吸光度（A2）。根據公式計算脂質體的柱回收率（%）=A1/A2×100%[9]。比較上柱前后吸光度的變化，結果見表2。

表2 空白脂質體柱回收率實驗結果（n=3）

2.3.4 凝膠微柱對美洲大蠊提取物的吸附實驗

精密吸取一定濃度的美洲大蠊提取物溶液0.5mL 加入到0.5mL 空白脂質體溶液中，將混合溶液緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項下條件，將收集的濾液入10mL 容量瓶，破乳定容后經f0.22μm 微孔濾膜過濾，按2.2.1 項下色譜條件進樣。另精密吸取同濃度美洲大蠊提取物溶液0.5mL 入10mL 容量瓶，同法進樣檢測。表明葡聚糖凝膠G-50 微柱可基本完全吸附游離藥物。結果見表3。

表3 美洲大蠊提取物柱吸附實驗結果（n=3）

2.3.5 包封率的測定

精密吸取美洲大蠊提取物脂質體混懸液0.5mL 緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項下條件，收集濾液入10mL 容量瓶，加入適量甲醇破乳，超聲15min 后用pH 6.6 PBS 定容，f0.22μm 微孔濾膜過濾，取續濾液按2.2.1 項下色譜條件進樣。計算包封率（EE），EE（%）=( 上柱后脂質體中藥物含量/上柱前脂質體中藥物含量)× 100%[10]。

2.3.6 重復性試驗

取同一批美洲大蠊提取物脂質體混懸液，按2.3.5 項下方法測定其包封率，重復3 次，結果分別為44.77%，45.63%，45.01%，RSD 為0.98%，符合測定要求。

2.4 制備工藝優化

在預實驗基礎上，選取大豆卵磷脂和膽固醇的質量比、卵磷脂和美洲大蠊提取物的質量比、有機溶劑體積、水化溫度為考察因素，以美洲大蠊提取物中成分尿嘧啶的包封率為指標，通過正交實驗優化美洲大蠊提取物脂質體的制備工藝，因素水平表見表4，正交試驗安排及直觀分析見表5，方差分析見表6。

表4 美洲大蠊提取物脂質體制備工藝優化正交實驗因素水平

表6 方差分析

表5 美洲大蠊提取物脂質體工藝優化正交實驗安排及直觀分析

由直觀分析可知，各因素對脂質體中尿嘧啶包封率的影響程度為A＞B＞C＞D 。以極差最小的D 因素為誤差項進行方差分析，結果發現因素A、B 具有顯著性，最佳處方A3B3C2D2,即最佳處方為藥脂比1:5，磷脂膽固醇質量比4:1，水浴溫度50℃，有機溶劑體積10mL。

2.5 美洲大蠊提取物脂質體的體外性質表征

2.5.1 脂質體形態

取適量最佳工藝美洲大蠊提取物脂質體混懸液，用適量3%的磷鎢酸負染，滴至銅網表面，待晾干后在透射電子顯微鏡下觀察，結果顯示脂質體外觀接近球形，形態完整，粒徑分布較為均勻，見圖2。

圖2 美洲大蠊提取物脂質體透射電鏡圖

2.5.2 粒徑與Zeta 電位

取適量最佳處方美洲大蠊提取物脂質體混懸液稀釋液，用納米粒徑電位分析儀檢測，測得平均粒徑233.7nm，多分散系數0.105，Zeta 電位為-28.3mV。

2.5.3 包封率

按最佳處方制備3 批美洲大蠊提取物脂質體，測定尿嘧啶包封率。所得包封率為（62.9±0.7）%，表明優選工藝所制備的脂質體包封率處于較穩定的水平。結果見表7。

表7 最佳處方包封率驗證

3 討論

美洲大蠊提取物中含有多種化學成分如核苷類、氨基酸類、多糖類、多肽類、油脂類等，核苷類物質是抗病毒、腫瘤等藥物的中間體，有重要的生物活性[11]。故本實驗選擇了美洲大蠊提取物中含量較高的核苷類物質尿嘧啶作為包封率測定指標。本實驗考察了甲醇、曲拉通X-100、氯仿等破乳劑對美洲大蠊提取物脂質體的破乳效果，結果證明破乳劑的量過大會使尿嘧啶的色譜峰分裂，最后選擇甲醇作為破乳劑，加入量應少于樣品10 倍量[12]。美洲大蠊提取物多為水溶性成分，故先嘗試了逆相蒸發法制備脂質體，結果證明逆相蒸發法制備的脂質體包封率低且不穩定，后采用薄膜分散法制備美洲大蠊提取物脂質體。通過預實驗及正交實驗，確定了薄膜分散法制備美洲大蠊提取物脂質體的最佳工藝。最佳處方為藥脂比1:5，磷脂膽固醇質量比4:1，水浴溫度50℃，三氯甲烷體積10mL。用該方法制備美洲大蠊提取物脂質體簡便可行，可為美洲大蠊提取物的制劑研究提供參考。