活血通絡湯對SANFH 兔造模過程中Notch1、HERP1 及bFGF表達的影響

蔡萬翔，王敏，李濤，江蓉星

（1.成都體育學院附屬體育醫院,四川 成都；2.重慶市中醫院,重慶；3.都江堰市醫療中心，四川 都江堰；4.成都中醫藥大學，四川 成都）

0 引言

股骨頭壞死（ONFH）系多因素損傷或中斷了股骨頭的血供，從而導致股骨頭骨髓成分與骨細胞死亡，最終股骨頭結構發生改變甚至塌陷，并出現相應臨床癥狀的難治性關節疾病[2]。長期或短期大劑量使用糖皮質激素已成為非創傷性股骨頭壞死的首要發病因素[3]。股骨頭血供的受損或中斷導致骨髓成分及骨細胞的死亡或凋亡是骨壞死必經的環節[4]。減少激素對股骨頭周圍血供的損傷，促進股骨頭周圍血管的穩定獲修復，抑制骨髓及骨細胞的死亡或凋亡進而促進骨組織及骨細胞的修復有利于降低或改善SANFH 的發生率。本次實驗基于中醫“未病先防”的特色指導思想結合前期實驗成果，動態監測Notch1、HERP1 及bFGF 的含量，并探討分析可能的相關作用機制，以期為防治SANFH 奠定理論基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

全雄性健康日本大耳兔，總共192 只，3 月齡，體質量2.0-2.5Kg，由四川大學華西醫院動物實驗中心所提供，檢疫合格（動物許可證號SCXK（川）2009-09）。單籠單兔飼養，標準條形飼料喂養，適應性喂養1 周。符合動物倫理要求。

1.2 藥物

醋 酸 潑 尼 松 龍 注 射 液（規 格：5mL:125mg，批 號：131102，浙江仙琚制藥）；注射用青霉素鈉（規格：0.48:80 萬U，批號：A1311002，哈藥集團制藥總廠）；硫酸慶大霉素注射液（規格：2mL：8 萬U，批號：20131112，四川長征藥業股份有限公司）。“活血通絡湯”方組成：黃芪、丹參、川芎、當歸g、懷牛膝、巴戟天、地龍、雞內金等（均按原方比例于成都市北京同仁堂購買，并加工成粉末；后制成中藥條形飼料，中藥所占20%比值）。

1.3 儀器與試劑

低溫離心機（型號：C2500 湖南湘儀實驗儀器廠）；實時熒光定量儀、熱循環儀（美國ThermoFisher 儀器有限公司）；旋渦混合器（江蘇康健醫療用品有限公司）；Rabbit NOTCH2 ELISA kit，Abcam 公司。電泳儀、電泳槽、化學發光凝膠成像儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機（常州中威電子儀器）；槍頭、EP 管（美國Axygen 公司）；轉輪式切片機（徠卡-2016，德國）；數碼三目攝像顯微鏡，BA400Digital（麥克奧迪實業集團有限公司）；圖像分析軟件（美國Media Cybernetics 公司）。

多聚甲醛（EM 級）、無水乙醇（AR 級）、二甲苯（AR 級）、蘇木素(AR 級）、硫酸鋁鉀（AR 級）、碘酸鈉（AR 級）、丙三醇（AR 級）、伊紅（AR 級）、氯仿（RNA 專用），實時熒光定量法（RT-PCR）檢測試劑-總RNA 抽提試劑（美國Invitrogen 公司）、免疫組化（S-P法）試劑（北京中衫金橋生物有限公司）、酶聯免疫吸附法（Elisa）試劑（bcam 公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組

將實驗大耳兔適應性喂養1 周后，準確稱重，然后隨機分成為四組：預防+治療組（A）、治療組（B）、模型對照組(C）與空白對照組（D），每組各48 只。

給藥方式：A 組從第2 周開始喂服中藥飼料（50g/kg.d）其余各組喂服普通飼料（50g/kg.d），每日1 次，連續1 周。從第3 周開始，A、B 兩組喂服中藥飼料（50g/kg.d），C、D 組連續喂服普通飼料（50g/kg.d），每日1 次，連續6 周。

1.4.3 造模

第3 周起，A、B、C 三組兔參照賀氏造模法開始造模[1]，在每只家兔臀部采取肌肉注射醋酸潑尼松龍注射液（8mg/kg），D 組家兔臀部注射同等劑量的生理鹽水，一周2 次，連續注射6 周。4 組家兔全部預防性注射使用青霉素（8 萬U/kg），慶大霉素（4 萬U/只），一周2 次，預防家兔感染。

1.4.4 標本采集

分別于第2、5、8 周末隨機從各組抽取8 只兔子，抽取兔耳緣靜脈血，抗凝，離心機分離，取白細胞和血清標本，低溫保存。處死兔子，截取股骨頭標本，放入10%甲醛中固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況

精神、運動、皮毛、體重、糞便等；

1.5.2 鏡檢

光鏡鏡檢：脫水、修整、包埋、切片、HE 染色、封片，鏡檢；

電鏡鏡檢：吸取固定液、洗滌、脫水、干燥、噴鍍等，鏡檢；

1.5.3 空骨陷窩率

在股骨頭軟骨區隨機選取10 個高倍視野，計算每個視野中所有骨陷窩數與空骨陷窩數（計算公式：空骨陷窩數/全部骨陷窩數×100%）；

1.5.4 Notch1、HERP1 基因表達值

采 用RT-PCR 檢 測；血 清 中bFGF：Elisa 檢 測，骨 組 織 中bFGF：S-P 法檢測。

1.6 統計方法

采用SPSS 17.0 for windows 統計軟件包進行統計分析處理，計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t 檢驗；計數資料采用%表示，檢測水準a=0.05。

2 實驗結果

2.1 一般情況

2.2 骨組織光鏡下觀察

表2 骨組織光鏡下觀察

表3 骨組織電鏡下觀察

2.3 骨組織電鏡下觀察

2.4 兔股骨頭空骨陷窩率結果（%）

表4 兔股骨頭空骨陷窩率結果（%）

由表4 分析空骨陷窩率：A、B、C 組均明顯高于D 組（P＜0.01）；A、B 組 明 顯 低 于C 組（P＜0.01）；在 第8 周 末 時：B 組 高 于A組（P＜0.05）；隨著實驗的進行，C 組呈上升趨勢； B 組增長趨勢弱于C 組；A 組在實驗后期呈下降趨勢。

2.5 Notch1 的基因表達檢測結果

表5 藥物對實驗家兔血清Notch1 蛋白基因表達值的影響

表5 藥物對實驗家兔血清Notch1 蛋白基因表達值的影響

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預防+治療組（A 組） 1.17±0.14 1.19±0.33 1.28±0.27治療組（B 組） 1.30±0.20 1.18±0.13 1.29±0.18模型對照組（C 組） 1.22±0.22 1.16±0.10 1.72±0.37##**空白對照組（D 組）0.62±0.33^^##** 1.21±0.23 1.51±0.17

由上分析Notch1 表達值：第2 周末時，A、B、C 組明顯高于D組（P＜0.01）；第5 周時，A、B、C、D 組各組間比較P ＞0.05；第8 周時，A、B 組均比C 組低（P＜0.01）。A 組第8 周比第2 周稍高，B 組第8周比第2 周略低，C 組、D 組Notch1 表達值升高的幅度比A 組大。

2.6 HERP1 的基因表達檢測結果

表6 藥物對實驗家兔血清中HERP1 濃度的影響（單位：ug/L）

表6 藥物對實驗家兔血清中HERP1 濃度的影響（單位：ug/L）

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預防+治療組（A 組） 1.29±0.16 1.51±0.30 1.61±0.16治療組（B 組） 1.51±0.24 1.60±0.16 1.78±0.26模型對照組（C 組） 1.48±0.48 1.80±0.22* 1.64±0.43空白對照組（D 組） 0.85±0.43 1.29±0.16##^^ 1.94±0.21

由上分析HERP1 表達值：第2 周時，各組間比較（P ＞0.05）；第5 周時，A 組低于C 組（P＜0.05），B 組高于D 組（P＜0.01），C組高于D 組（P＜0.01）；第8 周時，各組間比較（P＞0.05）。A 組、B 組2、5、8 周呈遞增的趨勢，C 組2、5 周呈增高的趨勢（第8 周略微下降），D 組增高趨勢大于A、B 組。

2.7 血清中bFGF 的檢測結果

表7 藥物對實驗家兔血清中bFGF 濃度的影響（單位：ng/l）

表7 藥物對實驗家兔血清中bFGF 濃度的影響（單位：ng/l）

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預防+治療組（A 組） 9.80±0.37 9.65±0.34 8.97±0.64治療組（B 組） 9.51±0.23* 9.64±0.28 8.74±0.83模型對照組（C 組） 9.45±0.19* 9.83±0.13 8.57±0.76空白對照組（D 組） 9.75±0.26 10.18±0.84 9.70±1.02^^#

由上分析bFGF 濃度：第2 周末時，A 組高于B、C 組（P＜0.05）；第5 周末時，各組間比較（P＞0.05）；第8 周末時，C 組明顯低于D組（P＜0.01）；B 組低于D 組（P＜0.05）；A、D 組間比較（P＞0.05）。

2.8 兔骨組織中bFGF 平均光密度

表8 藥物對兔骨組織bFGF 平均光密度的影響

表8 藥物對兔骨組織bFGF 平均光密度的影響

注：模型組與空白對照組（D 組）相比，**P＜0.01；其余3 組與模型對照組（C 組）對比，△P＜0.05 ，△△P＜0.01。

組別 N（只） OD預防+治療組（A 組） 24 0.2610±0.0118 △△治療組（B 組） 24 0.2528±0.0112 △模型對照組（C 組） 28 0.2453±0.0101 **空白對照組（D 組） 24 0.2709±0.0097

由上可知：C 組兔骨組織bFGF 明顯低于D 組(P＜0.01)；A 組兔骨組織bFGF 明顯高于C 組（P＜0.01）；B 組兔骨組織bFGF 升高（P＜0.05）。

3 討論

家兔的一般情況的變化情況，表明A、B 兩組的施加條件可抑制激素對家兔精神、毛色、體重、活動量的損害，且A 組略優于B組。從病理形態學及鏡檢結果表明A、B 兩組家兔的施加條件能降低空骨陷窩率，且A 組略優于B 組。研究發現長期或者短期大劑量使用激素能引起股骨頭軟骨下空骨陷窩率升高，即為早期股骨頭壞死[5]。所以實驗表明A、B 組的施加條件能抑制激素對家兔骨組織的損傷，且A 組抑制作用略強于B 組，即活血通絡湯能抑制家兔骨組織的損傷，且有一定的預防作用。

研究表明Notch 的高表達能抑制破骨細胞的表達，或者具有成骨作用[6]，也有相關文獻報道：Notch 信號對細胞成骨分化可能有抑制作用[7],李林等研究顯示Notch 信號參與了骨形成和成骨細胞的分化，并可能對骨形成和成骨細胞有抑制作用[8]。還有研究表明Notch 信號通路能作用于細胞的成熟過程中調節細胞的增值與分化[9]。由表5 可知活血通絡湯能抑制Notch1 的表達。所以單路分析可能是：活血通絡湯通過抑制Notch1 的表達：①從抑制破骨細胞的增殖或（和）促進成骨細胞的增殖分化，②通過促進破骨細胞的死亡或凋亡或（和）抑制成骨細胞的死亡或凋亡；從而調控成骨細胞和破骨細胞的平衡來達到治療SANFH 的作用。

HERP 是Notch 的下游靶基因，李斌元等認為HERP 參與了細胞的凋亡調節過程[10]，陳風雷等研究表明抑制HERP 表達能夠增強細胞自噬和抑制細胞死亡[11]。由表6 可知活血通絡湯可能是降低HERP1 的表達從而增強了破骨細胞的自噬而抑制了成骨細胞的死亡來達到治療SANFH 的作用，而A 組HERP1 的表達值低于B 組，說明A 組該項抑制作用強于B 組，表示活血通絡湯預防SANFH 的作用得到體現。實驗后期HERP1 對成骨細胞與破骨細胞的作用，可能即存在抑制成骨細胞細胞死亡的作用，也存在抑制破骨細胞死亡的作用，且后者有增強趨勢。

作為細胞因子的bFGF 具有多種生物學活性，從表7、8 實驗結果可知，活血通絡湯具有上調家兔中bFGF 的作用，且造模前給藥的上調作用強于造模開始后給藥的作用。bFGF 是具有促進血管生成作用的血管生成因子。CHRISTIANW 等研究表明:細胞因子bFGF 具有促進微血管形成、改善微循環的作用，并且參與新生血管形成的全過程[12]。由此可以推論活血通絡湯可能是通過上調兔血中bFGF 的含量，從而促進微血管形成，最終恢復股骨頭血運來達到預防與治療SANFH 的作用。細胞層面，有研究表明bFGF能促進成骨細胞的增值，而抑制破骨細胞的形成，從而促進骨的形成[13]。李鵬飛等研究發現，bFGF 對骨細胞的前期增殖起到有效的刺激作用，它合成并儲存在成骨細胞中，并且對軟骨細胞具有抗凋亡作用[14]。由此可以推測：活血通絡湯通過上調bFGF 的含量：①促進成骨細胞的合成、抑制破骨細胞的形成；②對軟骨細胞的抗凋亡作用；從而實現的治療或者預防SANFH 作用。李曉輝等通過研究發現bFGF 是多種細胞的絲裂原，可促進成骨細胞基因的表達和血管的生成[15]。bFGF 在治療股骨頭壞死方面具備一定的潛能和優勢。

在實驗中Notch1、HERP1 與bFGF 可能單獨的支路起作用，也可能是其中兩者或者三者之間在不同時間段Notch 信號通路的某一通路被激活，如Notch1- HERP1、Notch1-bFGF 或Notch1-HERP1-bFGF 等通路，從而增加Notch 受體胞內活性片段（Notch intracellular domain,NICD)的表達，促進下游靶基因的轉錄表達，從而參與對細胞、血管增殖分化以及細胞的凋亡/死亡的調控，進而促進成骨分化或降低破骨分化，最終達到治療SANFH。但其中的關聯作用還需進一步的設立對應的實驗來研究，以期為臨床主動防治SANFH 奠定進一步的理論基礎。