少陽生骨方含藥血清對Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的影響及機制研究

楊也，楊家福，鐘霞，黃銳，羅兵，瞿剛波，郝攀登，曾智江，袁俊，袁毅*

(1.西南醫科大學，四川 瀘州；2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州）

0 引言

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨組織微結構異常和骨量減少為特征，導致骨的脆性增加、骨微觀結構退行性變化和易發生骨折的一種全身性代謝性骨病[1]。隨著我國逐漸步入老齡化社會，骨質疏松癥及其并發癥將會給社會、醫療系統及家庭造成巨大的經濟負擔，骨質疏松癥這一公共健康問題也將受到越來越多的關注[2]。破骨細胞占骨骼細胞的1%～2%，是一種由單核巨噬細胞前體分化而來的具有吞噬骨組織能力的多核巨噬細胞，也是主導骨吸收的關鍵細胞[3]。破骨細胞的數量和功能與骨重建的動態平衡密切相關，因此減少破骨細胞的數量，抑制破骨細胞的活性和功能，是當前預防和治療骨質疏松癥的研究重點和難點[4]。

《黃帝內經》中最早明確提出了“少陽主骨”的觀點，《素問·熱論》曰：“少陽主骨”。“少陽主骨”可能是世界上最早認識到骨質疏松是一種全身性的骨骼病癥,具有非常重要的理論指導意義和臨床價值[5]。我院王鴻度教授基于“少陽生骨”理論自擬出了少陽生骨方，以“和解少陽”為治療原則，通過體表足少陽膽經調控骨強度的生理和病理變化，從而對以骨痛和易發骨折為主要臨床表現的骨質疏松癥有良好的治療作用[6]。少陽生骨方在臨床治療骨質疏松癥方面取得了良好的療效，但對治療骨質疏松癥的具體作用機制仍缺乏相關研究。本次實驗將以小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Mouse leukemia cells of monocyte macrophage，Raw264.7）為研究對象，通過核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-KB Ligand，RANKL ） 將Raw264.7細胞誘導成破骨細胞，同時加入不同濃度的少陽生骨方含藥血清進行干預，觀察抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色下不同組的破骨細胞形態和數目，并從基因蛋白水平上研究少陽生骨方對Raw264.7 向破骨細胞分化的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

25 只SPF 級雄性SD 大鼠，購自西南醫科大學實驗動物中心。所有SD 大鼠均按實驗室統一標準飼養。動物實驗在西南醫科大學實驗動物中心完成，動物實驗嚴格按照國際標準化操作流程執行。Raw264.7 細胞系（上海中國科學院典型培養物保存委員會細胞庫）。

1.2 藥物與試劑高糖

DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）、優質胎牛血清（gibco公司，美國）、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒（Solarbio公司，中國）、RANKL 誘導劑（Peprotech 公司，美國）、CCK-8 試劑盒（Dojindo 公司，中國）、RNA 抽提試劑盒（tiangen 公司，中國 ）、NF-κB p65 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）、Phospho-NF-κB p65 抗 體（Cell Signaling Technology 公 司，美國）、GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） Secondary Antibody, HRP Conjugate 二抗（BOSTER 公司，美國）。

1.3 主要儀器和設備

F50 倒置生物顯微鏡攝像（Olympus，日本）、3K15 低溫高速離心機（Sigma 公司，美國）、Bio-Tek 多功能酶標儀（Nikon 公司，日本）、熒光定量 PCR 儀(DNA Engine Opticon 2，Bio-rad，美國）等。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

將25 只SPF 級雄性SD 大鼠隨機分為5 個組，每組5 只，設立1 個對照組（灌胃2mL 純凈水），4 個不同劑量的含藥血清組（將少陽生骨方溶于2mL 純凈水中，含藥濃度分別為0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）；每天灌胃3 次，連續灌胃5d，在最后一次灌胃后，將大鼠麻醉滿意并行腹主動脈取血，制作4 組含藥血清、1 組無藥血清保存備用。

2.2 細胞實驗

將Raw264.7 細胞放入含完全培養基（含10% Gibco 胎牛血清+100 IU/mL 雙抗+DMEM 高糖培養基）的培養皿中，并置于5%CO2、37℃的培養箱常規培養，每48h 換液1 次，當細胞生長達到約80%-90%融合度時，使用移液槍輕柔吹打皿底細胞、傳代備用。

CCK-8 細胞增殖試驗：將Raw264.7 細胞以每孔2×103個細胞接種于96 孔板，分為5 組，1 個對照組（不處理組：只加入完全培養基），和4 個不同濃度的少陽生骨方含藥血清實驗組（0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL），每組3 個復孔。在孵育箱培養24h、48h、72h 后，棄去培養基，每孔加入10ul 的CCK-8 試劑和90ul 的完全培養基，并設立空白孔，只含有培養基和CCK-8 溶液，用酶標儀測波長在450nm 吸光度值并記錄結果,重復試驗3 次。

2.3 TRAP 染色試驗

將生長良好的Raw264.7 細胞以每孔1×104個細胞接種于24 孔板中，加入完全培養基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養，在細胞貼壁12h 后，去掉原培養基，加入含RANKL 的完全培養基誘導細胞分化，并根據不同的需求分組干預：1 組對照組：50ng/mLRANKL 完全培養基+10%0g/mL 含藥血清；4 組實驗組：50ng/mLRANKL 完全培養基+10%含藥血清（濃度0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）。每組均設3 個平行孔。待各組細胞誘導至第5 d 時進行TRAP 染色，具體方法參照試劑盒說明書進行操作。觀察TRAP 染色陽性破骨細胞的形態（胞體較大，細胞質內酶活性部位呈紫紅色，細胞核數目≧3）。并在100 倍視野下隨機選取10 個視野，分別對5 組細胞中TRAP 染色陽性的破骨細胞進行計數，取平均值，上述實驗重復3 次。

2.4 實時定量PCR 檢測

將生長趨勢良好的Raw264.7 細胞以每孔1×105個細胞接種于6 孔板中，細胞貼壁后更換培養液，將細胞分為6 組,每組3 個復孔。培養3d 后，按照試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，將RNA 反轉錄為cDNA，用RT-PCR 擴增儀對cDNA 產物進行RTPCR 反應。以GAPDH 為內參，檢測基因引物序列見表1，使用2-△△CT法分析Ctsk、C-fos、NFATc1 的mRNA 的表達，重復上述實驗步驟3 次。

表1 CTsK、NFATcl、c-Fos 和GADPH 的引物序列

2.5 Western bolt 測定蛋白表達

將Raw264.7 細胞常規培養傳代后，以每孔1×105個細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁后更換培養液，將細胞分為6 組（1 組空白組、1 組對照組、4 組實驗組）。培養3d 后，按照試劑盒說明書分別提取6 個組細胞的蛋白，并通過BCA 法進行蛋白定量，高溫100℃煮沸5min，使蛋白充分變性，經SDS-PAGE 電泳分離，然后轉膜，5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗(1：1 000 稀釋)，4℃搖床過夜，印跡膜用TBST 緩沖液漂洗3 次后，加入二抗(1：1 000 稀釋)，置于搖床上室溫孵育1h。在凝膠成像系統中曝光并拍照；采用Image j 圖像分析軟件，對光密度積分值進行分析。

2.6 統計分析

3 結果

3.1 少陽生骨方含藥血清對Raw264.7 細胞增殖的影響

CCK8 檢測結果如圖1 所示：培養第24h 時，與對照組相比，少陽生骨方含藥血清對各實驗組Raw264.7 細胞增殖的影響，差異無統計學意義（P=0.155）；培養第48h 時，與對照組相比，少陽生骨方含藥血清對各實驗組Raw264.7 細胞增殖的影響，差異無統計學意義（P=0.173）；培養第72h 時，與對照組相比，少陽生骨方含藥血清對各實驗組Raw264.7 細胞增殖的影響，差異無統計學意義（P=0.070）。

圖1 不同濃度少陽生骨方含藥血清對Raw264.7 細胞增殖的影響

3.2 不同濃度少陽生骨方對Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的影響

根據圖2 所示，5 組Raw264.7 細胞在加入50ng/mLRANKL 和不同濃度的少陽生骨方含藥血清干預5d 后，分化形成了TRAP 染色陽性的破骨細胞：破骨細胞的形態不一，有偽足和突起，細胞體積大，細胞質內酶活性部位呈紫紅色，且細胞核數目≧3。從圖3可知，與對照組（0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL）相比，隨著少陽生骨方含藥濃度的增加，各實驗組破骨細胞的數目逐漸下降，在含藥濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時，差異具有統計學意義（P＜0.01）。0.56g/mL 濃度的少陽生骨方對Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的抑制作用最強。

圖2 不同濃度含藥血清組TRAP 染色陽性細胞在細胞光鏡下（×100）

圖3 對照組及實驗組TRAP 染色陽性細胞數量

3.3 RT-PCR 檢測結果

根據圖4 所示，RT-PCR 檢測結果表明，加入50ng/mL RANKL 誘導劑后，對照組的破骨細胞標志性基因Ctsk、C-fos和NFATc1 分 別 為4.360±0.499 、3.192±0.130 、6.271±0.490，與空白組相比明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。當少陽生骨方含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時，Ctsk mRNA 的表達分別為3.403±0.118、2.472±0.309、1.589±0.319，與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。當少陽生骨方含藥血清濃度為0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL時，NFATc1 mRNA 的表達分別為2.743±0.229、2.147±0.086、1.644±0.060、1.175±0.040，與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。當少陽生骨方含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時，C-fos mRNA 的表達分別為3.950±0.541、2.999±0.483、1.928±0.258，與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

（空白組：0g/mL 含藥血清+0ng/mLRANKL；對照組：0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組1：0.07g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組2：0.14g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組3：0.28g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組4：0.56g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL。C-fos:傷害性信息與即刻早期基因；Ctsk：組織蛋白酶K；NFATc1：核轉錄因子激活的T 細胞1。與空白組比較：***P＜0.001；與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。）

3.4 Western blot 法檢測結果

根據圖5 所示，在使用不同濃度的少陽生骨方含藥血清干預Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的3d 后，與空白組相比，加入50ng/mL RANKL 的對照組出現了NF-κB P65 蛋白磷酸化的高表達，差異有統計學差異（***P＜0.001）；與對照組相比，在實驗組含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時，隨著濃度的增加，NF-κB P65 蛋白磷酸化水平逐漸下降，差異有統計學意義（***P＜0.001）。

空白組：0g/mL 含藥血清+0ng/mLRANKL；對照組：0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組1：0.07g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組2：0.14g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組3：0.28g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實驗組4：0.56g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL。與空白組比較：***P＜0.001；與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 討論

骨質疏松癥是一種骨量減少、骨組織微結構破壞，從而導致骨脆性增加、易發生骨折的全身代謝性骨病。骨質疏松是人體骨重建動態平衡失衡的結果，即破骨細胞主導的骨吸收超過成骨細胞主導的骨形成所致[7]。因此當前對骨質疏松癥的治療原則為抑制破骨細胞主導的骨吸收，以及促進成骨細胞主導的骨形成。目前通過抑制破骨細胞主導的骨吸收從而改善骨質疏松癥的藥物主要有雙磷酸鹽類、雌激素及其受體調節劑、降鈣素等[8]，但這些藥物具有價格昂貴、不良風險高等副作用，需要嚴格掌握其適應癥及使用時間。而我國傳統的中醫藥具有價格低廉、效果較好且副作用小等獨特的優勢，在臨床對骨質疏松癥的治療中發揮著越來越重要的作用[9]。

我院王鴻度教授基于《黃帝內經》中“少陽主骨”理論，在柴胡桂枝湯上加減自擬出了少陽生骨方，具體組成為：柴胡、桂枝、法半夏、黨參、甘草、黃芩、大棗、骨碎補、川牛膝、山茱萸等[10]。少陽生骨方以“少陽主骨”為理論依據，全方旨在寒熱平調、和解少陽、補腎健骨，通過多靶點的治療來改善骨質疏松癥的臨床癥狀，同時具有價格低廉、毒副作用低等優勢。課題組在前期研究中探索發現了少陽生骨方能促進骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖并向成骨細胞分化，從而改善骨質疏松癥相關癥狀，同時發現少陽生骨方促進BMSCs 成骨分化的機制可能與上調BMP-2 和Runx2 mRNA 和蛋白的表達有關[11]。但對于破骨細胞的作用及機制研究尚不明確，因此本次實驗旨在通過RANKL 誘導Raw264.7 細胞分化為成熟破骨細胞，探索不同濃度的少陽生骨方含藥血清對破骨細胞增殖分化的影響和作用機制。

Raw264.7 細胞是小鼠源性的單核巨噬細胞，也是破骨前體細胞的一種，通過RANKL 誘導Raw264.7 細胞分化成破骨細胞是目前體外研究破骨細胞最常用的培養方法[12]。本次實驗通過CCK8法發現不同濃度的少陽生骨方含藥血清對Raw264.7 細胞增殖的影響無明顯差異，表明少陽生骨方對Raw264.7 細胞無明顯細胞毒性，可以將0.07、0.14、0.28、0.56g/mL 的藥物濃度選為本實驗少陽生骨方含藥血清的藥物干預濃度。當RANKL 誘導劑與破骨前體細胞表面的受體RANK 結合，進一步激活NF-KB、NFAT 等下游信號通路。這些通路被激活后，破骨細胞分化的相關特異性基因如C-fos、NFATc1、Ctsk 等出現表達上調，使破骨前體細胞分化為成熟的破骨細胞[13,14]。本次實驗在RANKL 誘導Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的第5 天，通過TRAP 染色觀察不同組破骨細胞的形態和數目，發現隨著少陽生骨方藥物濃度的增加，TRAP 染色陽性破骨細胞數目呈藥物依賴性降低。說明少陽生骨方能抑制破骨細胞的增殖，減少破骨細胞的生成。Ctsk 即組織蛋白酶K，是破骨細胞作用中最主要的酶，Ctsk 可以通過調控破骨細胞的凋亡控制破骨細胞數量，在骨吸收中發揮關鍵作用[15]。C-fos 基因與NFATc1 是破骨細胞中重要的轉錄調節因子，C-fos 基因通過激活下游因子NFATc1 促進破骨細胞分化成熟，二者都是破骨細胞的增殖分化過程中至關重要的一部分[16,17]。本次實驗中，RT-PCR發現，與空白組相比，加入RANKL 的對照組Ctsk、C-fos、NFATc1的mRNA 呈現高表達。而與對照組相比，不同濃度的少陽生骨方含藥血清組Ctsk、C-fos、NFATc1mRNA 的表達，隨著濃度的增加呈濃度依賴性下降。說明少陽生骨方能抑制破骨細胞相關特異性基因Ctsk、C-fos、NFATc1 mRNA 的表達。

圖4 RT-PCR 比較不同組破骨細胞分化標志性基因表達情況

圖5 Western blot 比較各組細胞NF-κBp65 蛋白磷酸化的水平

NF-κB 是一種存在于細胞當中的至關重要的轉錄因子，不僅參與慢性炎癥的調節過程，同時也對維持機體的正常生理功能起著重要的作用。當RANKL 刺激NF-κB 活化后，IkB 激酶（IKK）復合物被激活，其中IKKβ 將IkB 磷酸化，使得IkB 被泛素化降解。IkB 被降解后，釋放的NF-κB p65 轉移到細胞核，與DNA 上的相關位點相結合，進一步促進破骨細胞特異性基因的表達，最終導致破骨細胞的形成和分化[18,19]。相關研究證實，通過抑制NF-κB的表達，可以抑制破骨細胞的增殖分化，進而改善骨質疏松癥狀[20]。本次實驗通過Western blot 法檢測不同濃度少陽生骨方對破骨細胞NF-KBP65 蛋白磷酸化水平表達的影響，發現少陽生骨方含藥血清能抑制破骨細胞 NF-κB p65 蛋白磷酸化。說明少陽生骨方抑制Raw264.7 細胞向破骨細胞分化的能力與抑制NFκB p65 蛋白磷酸化有關。

綜上所述，少陽生骨方能抑制Raw264.7 細胞向破骨細胞分化，當少陽生骨方含藥血清濃度為0.56g/mL 時，抑制作用最強。并且少陽生骨方抑制Raw264.7 細胞向破骨細胞的分化與對NFκB p65 蛋白磷酸化的抑制相關。本次實驗從基因蛋白層面證實了少陽生骨方能抑制破骨細胞主導的骨吸收，改善骨質疏松癥狀，為少陽生骨方治療骨質疏松癥提供了相關的實驗資料。