分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法測定水產品中利福平殘留

朱思華，張玉昆，劉振先，錢寶聰，李 冰，繆小群

( 1.佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000； 2. 廣東國康檢測技術有限公司，廣東 東莞 523000 )

利福平是一種人工半合成的強效抗生素，其主要作用機制為通過與菌體RNA聚合酶結合，干擾 DNA 和蛋白質合成，屬全效殺菌藥，對細胞內外結核菌均有殺滅作用，但它存在耐藥率高、易出現毒副作用等缺點，長期服用或與其他抗結核藥物聯合用藥在臨床病例中常出現肝毒性、胃腸道不適、過敏反應以及產生耐藥等不良反應[1-2]。

利福平未被批準為動物用藥，添加于動物飼料和飲水中及用于預防、治療疾病等均屬非法。美國、加拿大禁止在動物(包括食用動物) 疾病防治中使用利福平等抗菌素[3-4]，而我國早在2005年發布的第560號農業部公告就已將其列入獸藥廢止目錄[5]。但因該藥價格低廉，抗菌效果好，而且來源較廣泛，在水產養殖中存在人為非法使用的可能[6]。據相關水產養殖致病菌的耐藥分析研究，發現多種菌株對利福平藥物呈現出30%～80%不同程度的耐藥率[7-9]?？梢姡谒a養殖業中可能存在個別非法添加使用的情況，誘導菌株產生抗性。如果藥物仍殘留于食用水產動物機體中，通過食物鏈在人體內蓄積，其耐藥性有轉移擴散到人體的風險，對消費者的生命健康存在很大的隱患。然而，我國尚未建立關于利福平在水產品或相關動物性食品中的檢測標準[10]，從而無法對水產品中的利福平藥物殘留實施監控。

筆者選用高分離能力、高選擇性、高靈敏度的超高效液相色譜-串聯質譜法，并結合簡單、經濟、有效、可靠和安全的分散固相萃取前處理技術，建立了一種測定魚蝦等水產品中利福平藥物殘留的方法，對嚴格監控利福平藥物殘留，為消費者提供安全質量保證的水產品有重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品包括奧尼羅非魚(Oreochromiscoaureus×O.niloticus)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、中華鱉(Trionyxsinensis)、口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)、烏鱧(Ophiocephalusargus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、羅氏沼蝦(Macyobrachiunrosebergii)等，均為市售樣品。

標準品：利福平[CAS號：13292-46-1，含量以利福平(C43H58N4O12)計，100%]、利福噴丁[CAS號：61379-65-5，含量以利福噴丁(C47H64N4O12)計，100%]均購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙二胺-N-丙基硅烷PSA(40～63 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠C18吸附劑(上海安譜公司)；乙腈、二氯甲烷皆為色譜純(SccBayer)；甲酸、乙酸銨(色譜純，天津科密歐)、無水硫酸鈉(分析純，天津科密歐)。

1.2 儀器設備

API 4000超高效液相色譜—三重四極桿質譜聯用儀(美國AB Sciex公司)；高速冷凍離心機(安徽嘉文)；高速分散均質機(上海本昂)；HSC水浴氮吹儀(天津恒奧科技)；渦旋混合器(德國IKA公司)；移液器(Eppendorf)。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取適量利福平和內標利福噴丁標準品，分別用乙腈逐級溶解配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液、10.0 μg/mL的標準中間液以及利福平質量濃度為100 ng/mL和利福噴丁為1.0 μg/mL 的標準工作液，置-20 ℃保存待用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5 g均質樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL的利福噴丁內標標準使用液，加入10 mL提取劑乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)和5.0 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩3 min，超聲提取10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液移至干凈的20 mL試管中，5 mL提取劑重復提取1次，合并上清液，于40 ℃水浴氮吹至近干。

用初始流動相定容至2 mL，渦旋混勻，使殘渣充分溶解后，取1 mL復溶液于裝有100 mg C18、100 mg PSA吸附劑的2 mL離心管中，充分漩渦振蕩2 min，4 ℃，10000 r/min離心5 min后，取上清液經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.3.3 色譜條件

采用色譜柱為InertSustainSwift C18(3 μm, 2.1 mm×100 mm)；流動相：A為含0.05%甲酸的乙酸銨水溶液(3 mmol/L)，流動相B為乙腈相；梯度洗脫程序：0～0.20 min，20% B；0.20～1.00 min，20%～80% B；1.00～5.00 min，80% B；5.01～8.00 min，20% B，柱溫30 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.4 質譜條件

采用電噴霧正離子模式(ESI+)；質譜掃描模式為多反應監測(MRM)模式；氣簾氣(CUR)壓力為10 psi(1 psi=6.895 kPa)；碰撞氣(CAD)為4 psi；電噴霧電壓為5500 kV；離子源溫度為500 ℃；霧化器 (GS1)壓力為30 psi；輔助氣 (GS2)壓力為40 psi；其他質譜參數見表1。

表1 利福平及內標利福噴丁在多反應監測模式下的質譜參數

注：*為定量離子. Note：* indicates quantitation ion.

2 結果與分析

2.1 基質效應的考察

利福平的質譜響應信號可能會受基質效應所影響。本研究中采用奧尼羅非魚、凡納濱對蝦、中華鱉空白基質液稀釋標準溶液至含有利福平1、2、4、8、10、16、20 μg/kg系列含量的樣品標準溶液(均含20 μg/kg內標利福噴丁)，與同含量初始流動相稀釋系列標準溶液同序列進行液相色譜—質譜/質譜分析。通過計算初始流動相稀釋標準曲線及空白基質稀釋標準曲線的比值進行評價。結果空白奧尼羅非魚、凡納濱對蝦、中華鱉基質中的利福平藥物的基質效應值為1.18～1.29(初始流動相稀釋標準溶液的線性回歸方程為y=0.2589x+0.0983，r=0.9971)，存在一定的基質效應。故在樣品前處理中，采用分散固相萃取凈化方法進行優化，并結合基質匹配標準法以及內標法進行校正，以最大限度消除基質效應對測定結果準確性的影響。

2.2 線性關系、方法檢出限與定量限

本試驗中標準曲線采用基質匹配標準法進行，稱取相同質量的空白樣品，然后按“1.3.2”節所述樣品前處理方法提取后，用初始流動相定容，合并得到空白基質溶液，分別移取適量的利福平與利福噴丁標準工作液，用空白基質樣液稀釋標準溶液至含利福平1、2、4、8、10、16、20 μg/kg系列含量的樣品標準溶液，在“1.3.3、1.3.4”節所示的條件下上機測定，以待測物定量離子質量色譜峰面積與對應的內標峰面積比值為縱坐標(y)，標準溶液含量為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得到線性方程, 利福平在1～20 μg/kg的系列基質標液含量范圍內呈現良好的線性關系，相關系數(r)為0.9986～0.9993。以信噪比(S/N)≥3確定化合物的方法檢出限，以信噪比(S/N)≥10確定化合物的方法定量限，結果見表2，利福平在不同基質的方法檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，能滿足定量分析的技術要求[10]，方法具有較高的靈敏度。

表2 3種水產品基質中利福平的線性回歸方程、相關系數r、檢出限與定量限

2.3 方法的回收率與精密度

試驗中選取奧尼羅非魚、凡納濱對蝦與中華鱉3類水產品的肌肉組織進行基質加標回收試驗，驗證該方法的準確度和精密度。各種基質空白樣品中添加1、5、10 μg/kg低、中、高3個含量水平，每個加標含量設6個平行，按本試驗方法進行樣品處理和測定并采用基質匹配標準曲線進行定量分析，結果見表3，該藥物的平均加標回收率為90.17%～101.07%，相對標準偏差為3.11%～7.66%，可見方法具有較好的回收率和重現性，能滿足殘留檢測的要求。奧尼羅非魚空白樣品的TIC及MRM圖見圖1，添加5 μg/kg利福平奧尼羅非魚樣品的TIC及MRM圖見圖2。

2.4 實際樣品的檢測

采用本研究所建立的方法，對市場上購買的奧尼羅非魚、草魚、中華鱉、烏鱧、凡納濱對蝦、口蝦蛄、羅氏沼蝦等20個樣品進行檢測，結果發現在1份烏鱧的樣品中檢出有利福平，含量為21.6 μg/kg。

3 討 論

3.1 樣品前處理方式的選擇與優化

3.1.1 提取劑的選擇

利福平與利福噴丁均屬于利福霉素類抗生素，其具有相似的化學結構，易溶于乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑，難溶于水。試驗中以添加水平為10 μg/kg的奧尼羅非魚肌肉為試驗對象，考察了純乙腈、含體積分數1%甲酸的乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)、乙腈—二氯甲烷(4∶6，體積比)等多種提取劑對目標化合物的提取效果。結果表明，以乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)為提取劑的提取效果為較佳，平均回收率達96.7%，且能有效地沉淀樣品中的蛋白質和脂肪。因此，本試驗中選擇乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)作為提取劑。

表3 樣品中利福平的平均回收率和精密度(n=6)

圖1 奧尼羅非魚空白樣品的TIC及MRM圖

圖2 添加5 μg/kg利福平奧尼羅非魚樣品的TIC及MRM圖

3.1.2 凈化條件的優化

水產品樣品基質中含有較多的蛋白質、脂肪以及一些色素等干擾物質，水產品中藥物殘留的方法研究中通常選用PSA與C18作為樣品前處理中的凈化吸附劑，C18具有較好的去脂能力，而PSA可去除樣品基質中一些如脂肪酸、糖類、酚類和極性色素等物質[11-15]。因此，本研究選取PSA和C18作為分散固相萃取凈化的吸附劑，并以不同質量配比來比較凈化的效果，優化了二者的劑量。當使用100 mg PSA+100 mg C18凈化劑組合時獲得較好的凈化效果，且平均回收率達95%(圖3)，因此，本研究選擇以100 mg PSA+100 mg C18作為分散固相萃取凈化劑。

與李詩言等[6,16]所報道的采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化方式相比，本研究所用的凈化方法更具簡便、耐用和低成本的優勢，能應用于大批量水產樣品的實際檢測中。

圖3 不同比例的PSA與C18對利福平回收率的影響

3.2 色譜、質譜條件的優化

液質聯用儀的流動相常使用甲醇—水體系和乙腈—水體系。試驗選用甲醇和乙腈作為有機相；水，0.05%甲酸水溶液，0.1%甲酸水溶液，5 mmol/L乙酸銨水溶液，2、3、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%甲酸)作為水相，進行不同組合。結果表明，相同洗脫梯度下，以乙腈和3 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%甲酸)作為流動相組成時，目標化合物的響應強度大，峰型尖銳，且目標化合物周圍無明顯雜質峰干擾。優化后的高效液相色譜參數及梯度洗脫程序見“1.3.3”節。

質譜條件的優化試驗中，采用注射泵進樣的方式，分別將1 μg/mL利福平標準溶液和1 μg/mL內標利福噴丁標準溶液注入離子源中，在正離子模式下對利福平和利福噴丁進行一級質譜全掃描，得到分子離子，然后以分子離子作為母離子對其子離子進行全掃描，以MRM模式進行檢測。在此基礎上對碰撞能等離子源參數進行優化，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度比例最佳。最終確定“1.3.4”節所述的質譜條件。

3.3 方法的實際應用

采用本研究所建立的方法，在實際樣品中檢測出利福平藥物殘留，說明了在實際水產養殖過程中依然存在著個別違規使用利福平藥物的情況，應該引起相關部門的重視。

4 結 論

本研究通過將分散固相萃取法和超高效液相色譜串聯質譜法有效結合，建立了一種測定水產品中利福平藥物殘留的分析方法。通過優化色譜、質譜條件以及提取和凈化條件，并對水產品中奧尼羅非魚、凡納濱對蝦、中華鱉3種基質進行方法學評價，利福平在1～20 μg/kg內線性關系良好，平均回收率為90.17%～101.07%，相對標準偏差為3.11%～7.66%。該方法簡單、快速、準確，適用于水產品中利福平殘留的確證和定量分析。