超聲-微波協(xié)同提取紫云英籽油及脂肪酸組成分析

蔣新龍 蔣益花 張雨生

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

紫云英 (Astragalussinicus) 是豆科黃芪屬越年生草本植物，是南方稻區(qū)最主要種植和利用的綠肥作物，也是很好的蜜源植物與重要的青貯飼料原料來(lái)源[1]，還是美味蔬菜和制茶的原料，其根、莖、葉均具有一定的藥用價(jià)值[2，3]，其種子具有祛風(fēng)明目之功效[4]。對(duì)于紫云英種子的研究主要集中在新品種選育與鑒定[5]和提高種子發(fā)芽率方法[6，7]。目前，關(guān)于紫云英籽油的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為了科學(xué)、充分地利用紫云英籽油資源，對(duì)微波-超聲協(xié)同輔助提取紫云英籽油工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)GC分析其籽油脂肪酸組成，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫云英籽：市售。采用OLYMPUS DP72顯微鏡觀測(cè)，基本上為腎形，種子平均千粒重為3.25 g。紫云英籽經(jīng)揀選、干燥、粉碎后制成40～60目籽粉，備用。37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，其他試劑均為分析純。

CW-2000微波-超聲協(xié)同萃取儀，Agilent 7890B氣相色譜儀，UV-1600型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，AB204型分析天平，RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 紫云英籽油超聲-微波協(xié)同提取條件的優(yōu)化

1.2.1 提取方法

紫云英籽→除雜→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱重→加提取溶劑→微波-超聲協(xié)同萃取→抽濾→旋蒸除去溶劑→干燥→紫云英籽油。

精密稱取3.000 0 g的籽原料，置于100 mL儀器專用萃取瓶中，加入適量溶劑后攪拌使樣品良好分散于溶劑中。將萃取瓶置于儀器萃取爐腔中，安裝好冷凝回流裝置，分別設(shè)置微波功率、提取時(shí)間等參數(shù)，檢查完畢后開(kāi)啟微波及超聲(固定超聲條件：超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)進(jìn)行萃取。萃取結(jié)束后進(jìn)行減壓抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，濃縮物放恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥(110 ℃加熱30 min)，精密稱量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。按公式計(jì)算紫云英籽油的出油率。

式中：M為紫云英籽的質(zhì)量/g；M2為空瓶質(zhì)量/g；M1為空瓶和紫云英籽油的質(zhì)量/g。

1.2.2 提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

理想提取溶劑的確定：分別以正己烷、石油醚(60～90 ℃)、丙酮、無(wú)水乙醇作為提取溶劑，在微波功率200 W，提取時(shí)間120 s，液料比10 mL·g-1的條件下進(jìn)行萃取，以油脂品質(zhì)、出油率、溶劑價(jià)格、溶劑毒性為綜合考察指標(biāo)，確定理想的提取溶劑。

單因子實(shí)驗(yàn)：采用1.2.1超聲-微波協(xié)同提取法，提取條件：微波功率200 W、液料比10 mL·g-1，考察提取時(shí)間(60、90、120、150、180、210 s)對(duì)出油率的影響；提取時(shí)間150 s，液料比10 mL·g-1，考察微波功率(0、50、150、200、250、300 W )對(duì)出油率的影響；提取時(shí)間150 s、微波功率200 W，考察液料比(6、8、10、12、14、16 mL·g-1)對(duì)出油率的影響。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：根據(jù)提取時(shí)間、液料比以及微波功率3個(gè)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平，見(jiàn)表1。用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，選用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，做3因素3水平共 17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)因素水平表

1.3 紫云英籽油理化性質(zhì)分析

密度測(cè)定采用GB/T 5526—1985法；折光率測(cè)定采用GB/T 5527—2010法；酸價(jià)測(cè)定采用GB/T 5009.229-2016法；過(guò)氧化值測(cè)定采用GB 5009.227—2016法；碘值測(cè)定采用GB/T 5532—2008法；苯并(α)芘測(cè)定采用GB/T 22509—2008。平行3次，取平均值。

1.4 紫云英籽油的GC 成分分析

脂肪酸組成參照 GB/T 5009.168—2016的外標(biāo)法，用Agilent 7890B氣相色譜儀進(jìn)行GC 成分測(cè)定。

GC分析條件：色譜柱：CNW CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；檢測(cè)器類型：FID；檢測(cè)器溫度：260 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：130℃保持5 min，再以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃并保持30 min；分流比∶10∶1；載氣流速：0.5 mL/min。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法及分析軟件

以上指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的選擇

傳統(tǒng)浸提方法所用的溶劑不一定適合微波輔助提取[8]。微波輔助技術(shù)是利用微波場(chǎng)的體積加熱和選擇性加熱的功能。微波輔助提取溶劑的選擇不僅要考慮相似相容規(guī)律，還要考慮微波高選擇性加熱特點(diǎn)。溶質(zhì)和溶劑的極性越大，對(duì)微波能的吸收越大，升溫越快，對(duì)萃取越有利[9]。表2結(jié)果表明：相同提取條件，出油率從大到小依次為石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇、正己烷。從提取的油脂品質(zhì)考慮，石油醚和正己烷提取的油脂色澤淺、澄清度高，雜質(zhì)少。綜合各方面考慮選用石油醚(60～90 ℃)作為提取溶劑。

表2 不同有機(jī)溶劑對(duì)提取的比較

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1可知，紫云英籽油的出油率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，提取時(shí)間為150 s時(shí)，紫云英籽油的出油率最高。謝明勇等[9]研究表明，在微波萃取過(guò)程中，一般加熱1～2 min即可達(dá)到所要求的萃取溫度，不同的物質(zhì)，最佳萃取時(shí)間不同。本實(shí)驗(yàn)的最佳提取時(shí)間為150 s。

由圖1可知，隨微波功率的增大，紫云英籽油出油率不斷增大，當(dāng)微波功率達(dá)到200 W時(shí)，紫云英籽油的出油率達(dá)到最高。微波功率越大，物料內(nèi)部溫度升高越快，局部壓力變大，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，內(nèi)容物透過(guò)細(xì)胞壁流出并溶解到溶劑中的傳遞速度越快[10]。在微波功率達(dá)到 200 W 之后， 高微波功率導(dǎo)致的熱效應(yīng)使油分解或揮發(fā)，導(dǎo)致出油率有所減少[11]。

由圖1可知，隨著液料比的增加，紫云英籽油出油率不斷增大，在液料比達(dá)到10∶1mL·g-1時(shí)，出油率最高。提取溶劑用量的增加，增加了溶劑與紫云英籽細(xì)胞中油脂的濃度差，增加了傳質(zhì)推動(dòng)力，從而提高了油脂在提取劑中的擴(kuò)散速度。當(dāng)溶劑用量增大到一定程度后，紫云英籽油的出油率逐漸減少，這是因?yàn)楫?dāng)溶劑過(guò)大時(shí)，相同時(shí)間提供的熱量被提取溶劑吸收的比例增加，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等作用的強(qiáng)度減弱，影響提取效率，而且溶劑用量過(guò)大，會(huì)造成溶劑回收困難和生產(chǎn)成本增加。由圖1可知，液料比10 mL/g較為適宜。

圖1 微波-超聲協(xié)同提取紫云英籽油單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 相應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.1.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

2.1.3.2 方差分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。采用Designexpert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，提取時(shí)間(A)的P<0.05，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)籽油的提取影響顯著，微波功率(B)和液料比(C)P>0.05，說(shuō)明微波功率和液料比對(duì)籽油的提取影響都不顯著。方差分析說(shuō)明各個(gè)實(shí)驗(yàn)因子對(duì)籽油的提取影響由大到小的順序依次為：提取時(shí)間(A)、液料比(C)、微波功率(B)。方差分析也說(shuō)明各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.1.3.3 擬合模型的建立

對(duì)響應(yīng)面測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，確立回歸方程：Y/% =+31.41+0.46A+0.19B-0.22C+0.15AB+0.43AC+0.26BC-2.57A2-2.03B2-1.21C2

2.1.3.4 交互作用分析

在提取時(shí)間、液料比、微波功率3個(gè)因素中任取兩個(gè)作為X和Y，以出油率作為Z，作出相應(yīng)的三維曲面圖。相比而言，提取時(shí)間(A)和液料比(C)的交互作用較大，如圖2，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。圖2可知，提取時(shí)間(A)和液料比(C)的交互作用較大。

2.1.3.5 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

利用軟件繪出回歸模型的等高線，并確定模型的極大值點(diǎn)，預(yù)測(cè)所得最大籽油出油率為31.45%。利用軟件得出籽油提取的最優(yōu)條件：微波功率204.41 W、液料比9.86 mL·g-1、提取時(shí)間152.54 s。

圖2 三維曲面和回歸模型等高線

結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件，得到最優(yōu)條件為微波功率204 W、液料比10 mL·g-1、提取時(shí)間152 s。根據(jù)實(shí)際最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下測(cè)定籽油出油率，平行3次，得最大出油率為31.52%。根據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異。根據(jù)GB/T 14772—2008粗脂肪測(cè)定方法，測(cè)得紫云英籽粗脂肪含量為32.16%，而本最優(yōu)工藝得最大出油率為31.52%，說(shuō)明籽油基本上已經(jīng)提取完全，所以微波-超聲協(xié)同輔助法是短時(shí)高效提取紫云英籽油的方法。

2.2 紫云英籽油理化性質(zhì)

酸值是衡量油脂新鮮程度的指標(biāo)，酸值越小，說(shuō)明油脂中游離脂肪酸含量越小，油脂越新鮮[12]。由表5可知，紫云英籽油的酸值(KOH)為 2.61 mg/g，低于3.00 mg/g，符合GB/T 2716—2018食用植物油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。過(guò)氧化值是衡量油脂被氧化的程度。長(zhǎng)期食用過(guò)氧化值超標(biāo)的油脂，對(duì)癌癥腫瘤、心血管病等慢性病有促進(jìn)作用[13]。過(guò)氧化值數(shù)值越高，油品越差，紫云英籽油的過(guò)氧化值為7.72 mmol/kg，紫云英籽油的過(guò)氧化值低于食用植物油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。碘值是判斷油脂脂肪酸不飽和程度的指標(biāo)，紫云英籽油的碘值為130.2 gI/100 g，屬于干性油，說(shuō)明紫云英籽油不飽和程度較高。此外，紫云英籽油相對(duì)密度為 0.899 0，所制紫云英籽油為澄清透明的黃色液體。以測(cè)定的理化指標(biāo)判斷，紫云英籽油達(dá)到食用植物油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表5 紫云英籽油理化特性

注：GB/T 2716—2018標(biāo)準(zhǔn)要求：酸值/mgKOH/g≤3；過(guò)氧化值/g/100 g≤0.25，即過(guò)氧化值/mmol/kg≤9.85。

2.3 紫云英籽油脂肪酸組成及含量分析

根據(jù)1.4方法，對(duì)紫云英籽油進(jìn)行GC分析，紫云英籽油的脂肪酸組成分析結(jié)果見(jiàn)和表6。由表6可知，從紫云英籽油中共鑒定出20種脂肪酸，脂肪酸組成非常豐富。主要脂肪酸為亞油酸(37.58%)、亞麻酸(30.03%)、油酸(13.24%)、棕櫚酸(10.56%)、硬脂酸(3.48%)、芥酸(1.11%)，6種主要脂肪酸含量占95.99%。紫云英籽油不飽和脂肪酸含量為82.83%，以不飽和脂肪酸為主，這一結(jié)果驗(yàn)證了紫云英籽油具有較高的碘值。

亞麻酸(ω-3)可代謝為人體必需的EPA和DHA，具有預(yù)防老年癡呆、抗炎、降糖、降壓等作用[14]。亞油酸(ω-6)是人體合成前列腺素的前體物質(zhì)，亞油酸的主要功效體現(xiàn)在預(yù)防心血管疾病上[15]。因?yàn)閬喡樗岷蛠営退嵩谌梭w中均接受不飽和化酶和碳鏈延長(zhǎng)酶的作用，如果亞油酸攝入過(guò)量，會(huì)導(dǎo)致亞麻酸無(wú)法吸收[16]。亞油酸和亞麻酸比例過(guò)高將引起動(dòng)脈緊縮、引發(fā)亞麻酸缺乏癥及多種退化性疾病。較低亞油酸和亞麻酸比例則有助于抗炎和抗癌[16]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)在《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》一文中提出亞油酸和亞麻酸適宜比例為(4～6)∶1[16-17]。當(dāng)今人類飲食中亞油酸和亞麻酸比例已經(jīng)高達(dá)(10～30)∶1，文獻(xiàn)表明，ω-6/ω-3的最佳比值為1～4，ω-6 /ω-3比值降低，可以更好地減緩癌癥的發(fā)展，降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，改善骨骼健康[18]。紫云英籽油中，亞油酸(ω-6)與α-亞麻酸(ω-3)的比值為1.25。紫云英籽油的攝入可以降低膳食中ω-6/ω-3脂肪酸的比值。紫云英籽油含有豐富的亞油酸與α-亞麻酸，而且具有較低的ω-6 /ω-3比值，因而具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

表6 紫云英籽油脂肪酸組成

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)的理論與方法，確定最佳提取工藝：石油醚為提取劑，提取時(shí)間152 s，微波功率204 W，液料比10 mL·g-1。在此條件下，紫云英籽油出油率為31.52%。經(jīng)方差分析和響應(yīng)面圖得知，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)紫云英籽油提取率的影響作用大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>液料比>微波功率，且提取時(shí)間對(duì)紫云英油的提取影響顯著，三因素之間的交互影響都不顯著。實(shí)驗(yàn)證明，響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取法提取紫云英籽油的工藝條件。本實(shí)驗(yàn)建立的優(yōu)化模型對(duì)紫云英籽油的開(kāi)發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

紫云英籽油的理化指標(biāo)達(dá)到GB / T 2716—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》。GC 分析得到紫云英籽油主要成分有油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、芥酸，以多不飽和脂肪酸油酸為主，不飽和脂肪酸占82.83%。亞油酸(ω-6)與α-亞麻酸(ω-3)的比值為1.25。紫云英籽油具有較高的利用價(jià)值，可作為優(yōu)質(zhì)食用油源和功能性食用油開(kāi)發(fā)利用。