印度洋、西北太平洋龜螺屬和小龜螺屬種類的分類及DNA條形碼鑒定

李海濤，何靜，姜重臣，陳志云，周鵬

(1. 自然資源部南海環境監測中心，廣東 廣州 510300；2. 中國科學院南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣東 廣州 510301)

1 引言

工業革命以來二氧化碳大量排放導致的全球變暖和海洋酸化，已經對全球海洋生態系統產生了深刻影響[1-3]。無論是鈣化生物還是非鈣化生物，全球變暖和海洋酸化均會對其造成一系列影響，如影響基因表達、繁殖力、幼體成活率等[4-6]。此外，全球變暖和海洋酸化還會影響物種的分布、生物群落的多樣性和結構[7]。

有殼翼足類（Thecosome Pteropods）是海洋浮游動物的重要類群，在海洋食物鏈中扮演著十分關鍵的角色，它們不僅是重要的初級消費者，也是其他海洋生物和海鳥的餌料[8-9]。有殼翼足類的外殼主要由文石構成[10]，相比方解石，文石更易溶解于海水中[11]。因此，有殼翼足類被廣泛用作海洋酸化監測的指示物種[6, 12]。

準確的物種鑒定是開展海洋酸化等環境變化對翼足類影響研究的前提，因為不同的物種會對環境變化產生不一樣的響應[13]。然而，我國對翼足類的分類學研究仍遠遠不足。張福綏[14]在半個多世紀前較為系統地開展了中國海浮游軟體動物（包括翼足類、異足類和海蝸牛）的分類學研究，此后國內的分類結論[15]基本沿用了其觀點，鮮有其他關于浮游軟體動物的分類報道。國外學者[16-17]提出一些新的翼足類分類系統尚未被國內采用，許多分類錯誤也沒得到訂正，如張福綏[14]對強卷螺屬（Agadina）、厚唇螺（Diacriatrispinosa）和蛆狀螺（Cuvierinacolumnella）等種類的鑒定有誤[18-20]。DNA條形碼技術[21]的出現為物種鑒定提供了新的手段，該技術能有效回避鑒定者對生物個體形態差異的主觀認識和判斷。近年來，DNA條形碼技術已被廣泛應用于翼足類的分類學、種類鑒定和地理群體的遺傳分化等方面的研究[13,22-23]。

龜螺屬（Cavolinia）和小龜螺屬（Diacavolinia）是翼足類龜螺科（Cavoliniidae）龜螺亞科（Cavoliniinae）下的2個屬。目前，我國只采用了前1個屬，將后1個屬的種類均歸入到前者之中。有殼翼足類的分類主要是根據貝殼的形態特征，但由于其貝殼形態較為簡單，因而難以進行準確的物種鑒定[22]。龜螺屬和小龜螺屬的分類極為混亂，被人為建立了大量的亞種和變形[24-25]。比如，長期以來小龜螺屬被認為僅有長吻小龜螺（D. longirostris）1 個種[26-27]，后來 van der Spoel等[25]根據細微的形態差異將這1個種分出22個種及4個變形。但通過對比COI序列，分布于東北大西洋的小龜螺屬4個形態種被證明為同一物種[28]。因此，龜螺屬和小龜螺屬的種及種以下分類單元的有效性尚需通過分子手段來加以證實。本研究分析了西北太平洋和印度洋的龜螺屬和小龜螺屬種類的形態特征，同時結合線粒體COI和16S基因序列對其進行物種鑒定，以期解決兩屬部分種類的分類混亂和爭議，并揭示其地理遺傳分化。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

樣品于2016年至2018年采自西北太平洋（含南海）及印度洋海域的12個站位（圖1）。使用大型浮游生物網采用垂直拖網和水平拖網相結合的方式采集浮游動物樣品，絕大部分樣品為夜間用水平拖網的方式采集。海上采集的浮游動物樣品經篩絹過濾后用無水酒精固定（酒精使用量約為浮游動物體積的3～4倍），冰凍保存帶回實驗室。體視鏡下對目標種類進行分選和初步的分類鑒定，并編號拍照。共計43個標本用于DNA序列的分析（表1）。

2.2 DNA提取、PCR擴增和測序

取部分或整只動物，采用堿裂解法[29]提取DNA。使用引物LCO-1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和 HCO-2198 (5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′)[30]擴增COI基因片段；使用16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和 16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[31]擴增 16S rRNA基因片段。

圖1 采樣站點分布Fig. 1 Distribution of sampling sites

表1 樣品采集信息和基因庫（GenBank）登錄號Table 1 Collection information and GenBank accession numbers for specimens analyzed in this study

PCR反應體系總體積為50 μL，包括：2×擴增緩沖溶液25 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside Triphosphate，dNTP）400 μmol/L，引物各0.3 μmol/L，高保真 PCR 酶（TOYOBO，KOD FX）1.0 U，模板DNA 1 μL，加去離子水補足至50 μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性 2 min；98℃ 變性 15 s，53℃ 退火 30 s，68℃延伸60 s，共30個循環；最后68℃延伸10 min。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司進行回收純化和測序，COI基因片段進行雙向測序，16S rRNA基因片段進行反向引物測序（個別樣品為雙向測序），測序引物與擴增引物相同。

2.3 系統學分析

拼接、校對后的測序結果，首先利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列同源性檢索，并將COI基因序列在綜合性序列分析工具軟件DAMBE 5[32]中翻譯成氨基酸序列，以確保測序獲得的序列不是線粒體假基因（Nuclear Mitochondrial Pseudogenes）。本文測序獲得的序列連同基因庫（GenBank）中下載的其他序列，使用DAMBE 5內置的Clustal W程序進行多重序列比對。使用分子進化遺傳分析軟件MEGA 7.0[33]計算堿基的組成，基于Kimura 雙參數（Kimura 2-Parameter，K2P）模型計算遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，可靠性經過1 000次自展（Bootstrap）檢驗。采用進化樹分析軟件MrBayes 3.2[34]構建貝葉斯樹（Bayesian Inference，BI），分子進化模型使用核苷酸替換DNA進化最優模型分析軟件jModelTest 2.1[35]根據貝葉斯信息準則（Bayesian Information Criteria）標準計算得出。COI和16S rRNA基因的最佳進化模型分別為HKY+I+G和HKY+G。在馬爾可夫鏈蒙特卡羅（Markov Chain Monte Carlo）參數下運行 300 萬代，每100代抽樣一次，前2 500代作為老化樣本舍去。BI樹各分支置信度以后驗概率表示。使用進化樹作圖軟件FigTree 1.4.3顯示BI樹的拓撲結構圖。

3 結果

3.1 形態特征

在西北太平洋和印度洋海域共采集到4個龜螺屬種類，分別為鉤龜螺（C. uncinata）（圖2a至圖2c)、駝龜螺（C. gibbosa）（圖 2d）、球龜螺（C. globulosa）（圖 2e）和寬彎龜螺（C. labiata）（圖 2f）。其中，鉤龜螺的貝殼形態呈連續的變化，小個體的側棘（側突起）顯得更為發達，尾棘向背方彎曲的程度也更大（圖2a），腹殼接近圓形（圖2a至圖2b）；大個體的側棘不明顯，尾棘彎曲程度較?。▓D2c）。

圖2 龜螺屬種類的貝殼形態（比例尺為5 mm）Fig. 2 Shell morphology of Cavolinia species (scale bars: 5 mm)

小龜螺屬具有極其豐富的形態多樣性（圖3a，圖3c，圖 3e，圖 3g，圖 3i至圖 3l），其側突起尖銳（圖 3a，圖 3c）或極發達（圖 3i）或不明顯（圖 3j至圖 3l），背殼前緣部分凹陷（圖3e，圖3i至圖3k）或不凹陷（圖3g，圖3l）。參照文獻[25]進行形態鑒定，部分個體可明確鑒定為D. grayi（圖 3a，圖 3b）、D. vanutrechti（圖 3c，圖 3d）、D. pacifica（圖 3e，圖 3f）、D. elegans（圖 3g，圖 3h）和D. angulosa（圖 3j，圖 3k，圖 4）等形態種。部分個體難以進行形態種的劃分，如圖3i所示的標本與D. flexipes（圖4）的側突起一樣發達，但前者背殼前緣部分遠不及后者寬大。圖3l所示的標本，雖然其側突起不及圖3c的發達，但其形態特征與D. vanutrechti的正模標本（圖4）十分相似，故將其也定為D. vanutrechti。

3.2 序列分析

測序共獲得23條COI序列（GenBank登錄號MK913370～MK913392）和20條16S rRNA基因序列（GenBank 登錄號 MK913393～MK913412）。本文共計擴增了近30個小龜螺屬標本的COI基因，擴增并測序成功的12條序列，經BLAST比對和序列分析后發現，僅有1個標本（圖3l）的序列與GenBank中的同種（形態種）具有較高的同源性。其余11條序列與龜螺屬和小龜螺屬種類的同源性很低，且存在一段3 bp的插入/缺失片段，我們推測這些序列為線粒體假基因（序列未提交GenBank）。這些線粒體假基因均能正確翻譯為氨基酸序列，沒有產生終止密碼子，且核苷酸變異位點大多數（75.5%）為密碼子第三位堿基。

真正的線粒體COI序列長658 bp，A、T、G、C平均含量分別為24.3%、40.7%、18.0%和17.0%。線粒體假基因序列長655 bp，A、T、G、C平均含量分別為23.3%、38.3%、20.1%和18.3%。16S rRNA基因序列長 369～372 bp，存在 5個插入/缺失位點，A、T、G、C平均含量分別為30.7%、30.9%、21.5%和17.0%。所有序列的A+T的含量均明顯高于G+C的含量。

3.3 系統發育和遺傳距離

線粒體COI和16S rRNA基因的BI樹和NJ樹有大體一致的拓撲結構，本文只顯示BI樹或NJ樹（圖4，圖5）。在16S rRNA基因系統樹中，分布于西北太平洋的小龜螺屬D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D.elegans、D. angulosa等形態種聚為一個分支，并獲得很高的支持率（圖4）。因此，這些不同的形態種可能屬于同一物種，即長吻小龜螺（D. longirostris）。

圖3 不同形態類型的小龜螺Fig. 3 Different morphotypes of Diacavolinia

圖4 基于16S rRNA基因構建的小龜螺和其他腹足類鄰接系統發育樹Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic tree of genus Diacavolinia and other gastropods based on mitochondrial 16S rRNA gene sequences

COI基因系統分析結果表明，鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺在系統樹中均形成2個地理支系并獲得100%的支持率，且3個種類都分別形成大西洋和印度洋-西北太平洋地理支系（圖5）。其余種類則在COI系統樹中形成單系群。

COI基因的K2P遺傳距離分析表明，種內/支系內的遺傳距離在0～0.025之間，平均值為0.009；種間/支系間的遺傳距離則在0.082～0.393之間，平均值為0.232；鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺3個形態種不同支系間的遺傳距離則在0.102～0.246之間，平均值為0.137。16S rRNA基因的K2P遺傳距離分析表明，除1條D. angulosa（GenBank登錄號 MK913410）與其余序列遺傳距離較大外（0.039～0.053，平均值0.044），其余 19 條序列（包括D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D. elegans、D. angulosa等形態種）的遺傳距離在0～0.033之間，平均值為0.012。小龜螺屬與數據庫中唯一的1條翼足類16S rRNA基因序列（Clione limacine，AJ223406）的遺傳距離在0.400以上。

4 討論

本文對西北太平洋小龜螺屬標本16S rRNA基因序列的分析結果表明，D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D. elegans、D. angulosa等形態種可能為同1個種。Maas等[28]的研究結果也表明，東北大西洋小龜螺屬的4個形態種實為1種。因此，van der Spoel等[25]基于形態差異對小龜螺屬物種的劃分無法得到DNA數據的支持，可能過高估計了該屬的物種多樣性。側突起的發達程度，背殼前緣的凹陷程度這些連續變異的數量性狀顯然無法作為種類區分的依據。小龜螺屬的種類多樣性和分類學問題，尚需通過更大范圍的采樣并結合多方面的證據來解決。當前，將小龜螺屬作為單型屬處理更妥，即僅包含長吻小龜螺一個種。

圖5 基于COI基因構建的龜螺屬和小龜螺屬貝葉斯系統發育樹Fig. 5 Bayesian inference phylogenetic tree of genera Cavolinia and Diacavolinia based on mitochondrial COI gene sequences

寬彎龜螺在我國被作為C. inflexa的變種來處理[14]，前者與后者存在明顯的形態差異[36]，且系統學分析也支持前者為獨立種。鉤龜螺被分為2個亞種（圖5手繪圖），亞種之下又被分為5個變形[24]。這種精細的劃分為種類鑒定和其他研究帶來極大的混亂。物種具有形態可塑性，棲息環境可能影響其形態特征，不同發育階段的個體往往也具有一定的差異。我們獲得的不同大小的鉤龜螺存在一定的形態差異（圖2a至圖2c），如小個體側棘的發達程度和尾棘的彎曲程度更大。尤其是我們獲得的最大標本（圖2c），殼寬可達10 mm，明顯大于張福綏[14]和van der Spoel[24]所記錄的標本（小于6.5 mm）。

開放的海洋環境沒有限制物種分布的地理障礙，終生浮游生物或是其他海洋生物的階段性浮游幼體也有較強的擴散能力，因而許多物種被認為分布廣泛。然而，一些所謂的環球或環極地分布的物種（形態種）實際上是一些局限性分布的隱存種，形態種生物多樣性無法反映真實的物種多樣性[37-39]。鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺在COI系統樹中均形成明顯的地理支系，產生了明顯的地理遺傳分化，不同支系間的K2P遺傳距離都大于3%的閾值[21]，其內部可能存在隱存種。

線粒體基因在物種鑒定和系統進化等領域得到了廣泛應用。然而，線粒體假基因的存在為上述研究造成了一定程度的干擾。線粒體假基因通常極易被通用引物擴增出來，甚至是優先被擴增出來[40]。本文擴增得到真正線粒體COI基因序列的比例極低，這提醒我們在開展DNA條形碼研究的時候應防范線粒體假基因的干擾，否則會得出錯誤的結論。

致謝：中國科學院南海海洋研究所周林濱博士采集了印度洋樣品，李開枝研究員在實驗過程中給予了幫助和支持，謹致謝忱。