縊蟶（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮脅迫下的表達特征分析

張歡，董迎輝，姚韓韓，俞凱佳，胡月亞，林志華*

(1. 寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315823；2. 浙江萬里學院 生物與環境學院 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

1 引言

隨著水產養殖集約化的發展，養殖動物的排泄物、糞便和殘餌積累分解，導致水體中氨氮濃度偏高[1]。據報道，添加到養殖系統中的氮源（通常在餌料中）有52%～95%未被利用，導致水體中氨氮濃度急劇升高[2]。在水環境中，氨氮主要以游離氨（NH3）和離子氨（NH4+）兩種形式存在，二者之和為總氨氮（Total Ammonium Nitrogen，TAN）。NH3由于脂溶性易穿過細胞膜進入體內，而其在體內累積則會導致機體中毒，甚至死亡[3-5]。氨氮作為水產養殖環境的脅迫因素之一，其濃度升高顯著影響機體內氨基酸代謝、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）代謝、抗氧化過程和免疫應答等過程，從而嚴重影響養殖動物的生存和養殖業的發展[6-8]。

氨氮中毒的早期特征主要是體內積累過量的氨、ROS、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等，繼而導致氧化應激、機體損傷等[9]，而氨誘導大量生成的ROS是引起細胞毒性的重要因素之一[10-12]。在氨氮暴露后，羅非魚（Oreochromis niloticus）肝和肌肉中的氧化酶活力顯著升高，以應對氨引起的氧化應激[13]，而歐洲鱸魚（Dicentrarchus labra）[14]、亞馬遜河蝦（Macrobrachium amazonicum）[15]則引起體內第二階段抗氧化酶活性的改變。谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione S-trans-ferases，GST）作為抗氧化系統中第二道防線的主要成員，主要參與有害親電性的內源性和外源性化合物的解毒過程，包括脂質過氧化產物和致癌物、環境污染物[16-17]。GST 還催化谷胱甘肽（Glutathione，GSH）與親電子外源化學物結合，將毒性物質轉化成易排泄的水溶性形式[18]。由于其對環境污染物的解毒能力，水生動物中的GST已被廣泛用作監測水環境污染的生物標志物[17,19]。環境污染物（如重金屬、微生物、氨氮等）還可以誘導第二階段解毒酶的基因表達[16-17,20]，但目前關于氨氮脅迫導致GST基因變化的報道很少[21]。氨氮會損害生物的許多生理功能，如干擾蛋白質折疊和運輸[22]。蛋白水平的研究表明，氨氮脅迫下表達水平發生顯著改變的蛋白主要參與蛋白質合成和轉運，并且抵抗應激刺激[23]，如氨誘導暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）肝臟中熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSP70和HSP90）顯著表達，表明氨可引起機體啟動應激機制以保護細胞免受損傷[4]。而作為分子伴侶，HSP有助于細胞從脅迫中恢復，其是具有重折疊應激變性蛋白或協助新生蛋白折疊功能的高度保守性應激蛋白，并調控多種細胞過程（如應激防御、細胞周期控制和細胞凋亡）[22,24]。作為熱休克蛋白家族的重要成員，HSP90可應對多種環境因子脅迫，其主要通過形成特定復合物來維護關鍵蛋白，如類固醇受體和蛋白激酶[22]。由于HSP90在保護生物體免受損害方面具有重要作用，可對多種環境因子脅迫進行調節，被作為監測水環境健康的敏感生物標志物[24]。有研究表明，氨可誘導脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[25]和櫛孔扇貝（Chlamys farreri）[26]HSP90的表達。

縊蟶（Sinonovacula constricta）是我國海水池塘綜合養殖的重要底棲經濟貝類，其具有養殖周期短、營養價值高、味道鮮美等優點，在浙江、福建等東南沿海廣泛養殖，2017年全國養殖總產量達到86.2萬t[27]。縊蟶由于埋棲、濾食及開放式循環特點，易受到水體污染物的暴露和有害影響，同時對污染物也具有較高的耐受性[28-29]。本研究對Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因的序列特征、組織表達和氨氮脅迫后的表達特征進行分析，了解氨氮對水生動物的早期毒性作用和機體潛在防御機制，以期為縊蟶大規模安全養殖提供科學指導。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗用縊蟶（殼長（63.42±1.57）mm）于 2018年4月采自寧波市海洋與漁業研究院科技創新基地。取健康無病、規格基本一致的20顆縊蟶，用2 mL無菌一次性注射器從后閉殼肌取血，置于凍存管中，并解剖取其鰓、肝胰腺、足、外套膜、水管和閉殼肌，液氮速凍后保存在-80℃超低溫冰箱中，用于后續RNA提取。

2.2 氨氮暴露實驗

暴露實驗前清潔縊蟶殼表污物，暫養在鹽度22、溫度15℃的海水中，24 h連續充氣，每日全換水1次，暫養期間定時投喂亞心形扁藻。暫養7 d后進行實驗。

實驗分別設置對照組和實驗組，每組隨機放置80顆縊蟶在100 L水體中，以自然海水中的氨氮濃度作為對照組，實驗組氨氮依據半致死濃度（244.55 mg/L，本實驗室未發表數據）分別設置為140 mg/L和220 mg/L，每天全換水兩次，實驗期間水體鹽度為22.76±0.92、pH 值為 8.17±0.43、水溫為（15.24±3.85）℃，不投餌、不充氣，每6 h測定各組氨氮濃度，及時用NH4Cl母液調節氨氮濃度。實驗進行到0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h后，每組隨機取6顆縊蟶，解剖取肝胰腺，液氮速凍后保存在-80℃超低溫冰箱中。

2.3 Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因cDNA全長克隆

利用TRIzol試劑（Omega）提取肝胰腺總RNA，采用分光光度計（GE Healthcare，Nanovue Plus）測定RNA的濃度和純度，并通過電泳檢測其完整性。通過 SMARTTMRACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）試劑盒（TaKaRa）將RNA合成cDNA第一鏈，作為全長克隆的模板。在縊蟶轉錄組庫中檢索GST和HSP90基因的EST序列，通過Primer5.0設計克隆引物（表1），根據采用聚合酶（Advantage 2 Polymerase Mix Kit，TaKaRa）進行2個基因的全長擴增，擴增產物經電泳檢驗后進行回收純化，純化的產物與載體T1（TransGen）連接后導入到感受態細胞中，經12 h培養后篩選陽性克隆進行測序。測得的序列利用DNAMAN6.0拼接得到其cDNA全長序列，為確定克隆和測序的準確性，以得到的全長cDNA為模板設計一對特異性引物（表1）進行PCR擴增驗證。

2.4 cDNA全長序列分析

獲得的cDNA全長序列通過開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）查詢器（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測ORF及氨基酸序列；通過蛋白質專家分析系統（Expert Protein Analysis System，Ex-PASy）在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）預測蛋白質的分子量和等電點；分析蛋白質疏水性（Ex-PASy-ProtScale，https://web.expasy.org/protscale/）；預測氨基酸是否存在信號肽（SignalP，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；利用 Smart在線軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白進行功能域預測，通過Swiss Model在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白質高級結構；利用美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫中的本地序列基本搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行序列比對，搜索同源序列；利用MEGA5.2軟件構建系統進化樹，利用DNAMAN6.0軟件進行同源序列的多重比較。

表1 本實驗所用引物及序列信息Table 1 The information of primers and sequences used in this experiment

2.5 熒光定量PCR分析

提取縊蟶組織的總RNA，用專用反轉錄試劑（TaKaRa，PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser）進行RNA反轉錄，得到實時熒光定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）cDNA 模板。根據全長序列設計熒光定量引物（表1），以核糖體蛋白S9（Ribosomal Protein S9，RS9）基因作為內參基因[30]。用定量 PCR 儀（Roche，LightCycler?480）進行 qRTPCR擴增，每組樣本設定4個平行，3個重復，所得數據采用2-ΔΔCt法對相對表達水平進行計算，結果以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，利用 SPSS13.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

3 結果

3.1 Sc-GSTσ基因cDNA全長序列分析及特征分析

克隆得到Sc-GSTσ基因cDNA全長序列為1 414 bp（GenBank登錄號：MK301159），包含 639 bp的 ORF，編碼212個氨基酸，根據氨基酸序列推導出Sc-GSTσ基因編碼蛋白質的分子量為24.54 kDa，理論等電點為7.68。ExPASy-ProtScale軟件預測顯示，該蛋白質在氨基酸組成上，極性氨基酸所占比例較高，表現為親水性，且沒有明顯的信號肽。預測Sc-GSTσ蛋白含有2個功能域，即GST-N（3-84 aa）和GST-C（86-212 aa）（圖1a），其二級結構由271個H鍵、螺旋數25和42個轉角組成。

同源氨基酸序列比對顯示，Sc-GSTσ與菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum，AEW46327.1）GSTσ 的同源性及同源性數據最高（43.40%），與紫貽貝（Mytilus galloprovincialis，AFQ35985.1）、海灣扇貝（Argopecten irradians，ANG56313.1）、刺參（Apostichopus japonicus，PIK56346.1）等無脊椎動物的同源性在26.67%～40.49%，與人（Homo sapiens，O60760.3）、小家鼠（Mus musculus，Q9JHF7.3）、家雞（Gallus gallus，O73888.3）等脊椎動物的同源性為26.67%～29.52%。GSTσ同源序列比對顯示，Sc-GSTσ的保守性較低。Sc-GSTσ與其他無脊椎動物GST和脊椎動物PGD進行多重比較，確定N端結構域顯示較保守，C端結構域多樣（圖1b，圖1c）。系統進化樹結果顯示，產生了4個不同的簇，分別是σ、Mu、Ω和微粒體GST，其中微粒體GST與其他3個類群保持相當大的遺傳距離。每一類貝類GST與無脊椎動物GST的位置非常接近，而Sc-GSTσ與菲律賓蛤仔GSTσ3最親密，其亞群及分支表明縊蟶Sc-GSTσ確實為σ亞型（圖2）。

3.2 Sc-HSP90基因cDNA全長序列分析及特征分析

Sc-HSP90基因cDNA全長序列為2 752 bp（Gen-Bank登錄號：MK301157），其中含有 2 181 bp的 ORF，編碼726個氨基酸。根據氨基酸序列推導出其編碼蛋白質的分子量為83.10 kDa，理論等電點4.78。Ex-PASy-ProtScale軟件預測顯示，該蛋白質表現為親水性，沒有明顯的信號肽。Smart軟件預測得到Sc-HSP90蛋白也含有2個功能域，分別是HATPase-C（35-189 aa）和 HSP90（191-720 aa），其中含有 5 個家族標簽序列（35NKEIFLRELISNASDALDKIR55，102L G T I A K S G T110，126I G Q F G V G F Y S A136，354IKLYVRRVFI363，380GVVDSEDLPLNISRE394）。Swiss model軟件預測顯示，Sc-HSP90蛋白的二級結構由448個H鍵、螺旋數31和72個轉角組成。

序列同源性分析表明，Sc-HSP90氨基酸序列與已知物種序列的同源性超過70%。與其他軟體動物的HSP90的同源性超過79%，其中與河蜆（Corbicula fluminea，AMM04544.1）和菲律賓蛤仔（AHY275448.1）的同源性最高，分別為88.32%和87.05%。多重序列比對表明，Sc-HSP90具有高度保守性，特別是在HSP90家族標簽區域（圖3a）。系統進化樹結果顯示，這些蛋白分為兩個簇，一簇包含軟體動物、甲殼動物和脊椎動物，另一簇包含兩個昆蟲綱。所有脊椎動物聚集在一起，形成兩個分支（HSP90α和HSP90β亞型）。而甲殼動物聚集在一起，與軟體動物分支互為姐妹群。顯然，Sc-HSP90與軟體動物HSP90聚為一亞支，并與菲律賓蛤仔、河蜆的HSP90親緣關系最近（圖3b）。

圖1 Sc-GSTσ結構域和多重比較Fig. 1 Sc-GSTσ domain structure and multiple sequence alignment

圖2 利用MEGA5.2軟件鄰接法構建的GST的系統進化樹Fig. 2 The phylogenetic tree of GST constructed by Neighbor-joining method using MEGA5.2 software

3.3 Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因在縊蟶7個組織中的表達模式

利用qRT-PCR技術檢測了Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因在鰓、肝胰腺、足、外套膜、血液、水管和閉殼肌7個組織中的表達。結果表明，Sc-GSTσ在肝胰腺中的表達量最高，顯著高于其他6個組織（p＜0.05），而其他組織間表達量沒有顯著性差異（圖4a1）。Sc-HSP90基因也在肝胰腺中表達量最高（p＜0.05），其次是鰓、血液和水管，外套膜中表達量最低（圖 4b1）。

3.4 Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因在氨氮脅迫下的表達特征分析

圖3 Sc-HSP90基因鑒定及系統進化樹Fig. 3 Sc-HSP90 gene identified and phylogenetic tree

氨氮脅迫后縊蟶肝胰腺中Sc-GSTσ和Sc-HSP90的mRNA水平升高（圖4）。在140 mg/L氨濃度暴露下Sc-GSTσ基因在肝胰腺中的表達量持續上升，在48 h達到峰值，顯著高于對照組（p＜0.05），隨后表達量顯著下調，72 h恢復到對照組水平，然而96 h又顯著高于對照組。而在220 mg/L氨濃度暴露下，Sc-GSTσmRNA表達水平在3 h顯著上升，在6 h達到最大值，但隨后顯著下降，在24 h下降到與對照組無顯著性差異，然而之后又緩慢上升直至96 h（圖4a2）。

圖4 Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因在縊蟶不同組織中及不同氨濃度脅迫后的表達特征Fig. 4 The expression characteristics of Sc-GSTσ and Sc-HSP90 genes in different tissues of S. constricta and after different ammonia concentration stress

在140 mg/L和220 mg/L氨氮脅迫下，Sc-HSP90的轉錄水平呈現先升后降的趨勢，分別在48 h和 24 h 達到峰值，顯著高于對照組（p＜0.05），140 mg/L氨氮脅迫72～96 h其表達量有所下降，但仍顯著高于對照組，而220 mg/L氨氮脅迫72～96 h表達水平恢復到對照組水平（圖4b2）。

4 討論

GST作為具有解毒和抗氧化等多種生理功能的蛋白酶，在哺乳動物和水生動物中已被廣泛研究[17,31-32]。本研究克隆得到Sc-GSTσ基因的全長cDNA，其氨基酸序列與其他動物GST氨基酸序列比對顯示相似度不高，該結果與曼氏無針烏賊（Sepiella maindroni）、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）GST基因的分析結果相似[19,33]。Sigma型GST是一個大家族，包括來自不同有機體的亞型，因此不同物種GSTσ型之間的同源性較弱。結構域分析表明，在Sc-GSTσ N端含有一個GST_N結構域，該結構域是GSH結合位點（G位點），還存在一個相當保守的酪氨酸殘基（Try，Y5）在催化反應中起重要作用，而且在C末端還存在一個GST_C結構域，是親電子物質即底物結合位點（H位點）。對GSTσ的結構域比較分析表明，所有物種均存在N末端和C末端結構域，但多重比較發現含有G位點的N末端區域較保守，其與GST功能緊密相關，而含H位點的C末端顯示出高度變異性，這種差異可能表明物種間存在底物特異性[34-35]。

作為應激蛋白中的重要成員，熱休克蛋白已被廣泛研究，其中對縊蟶熱休克家族的研究包括Sc-HSP70[36]和小分子熱休克蛋白Sc-sHAP[37]，而關于HSP90的報道尚未見到。在本研究中，推導Sc-HSP90氨基酸序列發現，其具有HSP90家族標簽序列和腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）結合域，這與哺乳動物和水生動物的研究一致[38-40]。根據C末端存在722MEEVD726序列，則Sc-HSP90屬于細胞溶質HSP90家族[40-41]。序列多重比較表明，縊蟶Sc-HSP90序列具有高度保守性，基于系統進化樹分析進一步表明，Sc-HSP90是HSP90家族成員。在系統發育樹中，脊椎動物存在HSP90α和HSP90β兩個亞型。相比之下，大多數無脊椎動物只有一個HSP90基因。與所有脊椎動物HSP90β亞型一樣，Sc-HSP90氨基酸序列N末端缺少α亞型特有的dsDNA依賴激酶磷酸化位點[39-41]。這些結果表明，Sc-HSP90應該屬于HSP90β亞型家族。

本研究通過qRT-PCR方法檢測氨暴露下Sc-GSTσmRNA在肝胰腺中的轉錄水平，結果表明在氨氮脅迫下Sc-GSTσ轉錄水平顯著上升，隨著暴露時間推移表達水平下降，接近正常水平，并且高濃度氨氮脅迫下Sc-GSTσ的表達水平明顯低于低濃度氨氮脅迫，這與暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）[12]、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[42]、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）[8]的研究結果相似。由此表明，縊蟶對氨氮脅迫較敏感，氨氮脅迫初始階段下GST基因高表達參與氨氮的解毒過程，但在氨氮持續脅迫下，GST的表達降低，解毒能力減弱。研究表明持續脅迫下，抗氧化防御系統未能及時清除ROS，其在體內過度積累，導致機體代謝能力的降低，從而影響相關基因的表達[21,42]。此外，機體氧化應激強度隨著氨氮濃度的增加而增加[13]，氨在水生動物組織中積累，引起機體釋放大量ROS，導致氧化損傷[42]。黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）血液中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性在高濃度氨氮脅迫下低于低濃度氨氮脅迫，而且在高濃度氨氮脅迫下體內MDA含量顯著升高[43]。氨氮脅迫后期或高氨氮脅迫下體內會累積過量的自由基，超出機體的清除能力，從而造成脂質過氧化，加劇細胞和組織損傷。由此表明，抗氧化酶mRNA的表達是具有時間和劑量依賴性的，并且與機體的代謝能力相關[24]。Sc-GSTσ基因表達上調表明，GST的表達量可以用作指示環境氨氮毒性的生物標記。

ROS對機體細胞有害，具有毒性誘變作用，可誘導蛋白質變性或蛋白毒性[22]。氨除了誘導ROS的大量生成，還可能會干擾體內蛋白質和氨基酸平衡、運輸，增加細胞中蛋白質碎片化和聚集[44]。研究發現氨誘導草魚（Ctenopharyngodon idella）[24]、寬體沙鰍（Aeromonas hydrophila）[22]、山黃鱔（Monopterus cuchia）[44]肝臟中HSP90的表達水平上調，而在本研究中氨氮脅迫下縊蟶肝胰腺中Sc-HSP90表達量顯著上升，達到峰值后顯著下降。這表明氨氮脅迫下，體內高表達的HSP90可能有助于防止蛋白質變性或損傷從而保護細胞免受損害，這可作為縊蟶對氨氮脅迫的適應性反應。此外其高表達量也可能意味著高氨氮脅迫造成機體高水平的蛋白損傷，其基因表達的增加，可能表明機體對氨氮脅迫的耐受性的增強[45]。然而，隨著脅迫時間延長而表達量減少，這可能是由于HSP90修復受損DNA和蛋白的能力有限，變性的蛋白在體內累積，影響正常細胞的代謝能力[26]。

5 結論

本研究克隆得到Sc-GSTσ和Sc-HSP90基因的cDNA全長序列，同源性分析表明，它們均與菲律賓蛤仔的同源性最高。這2個基因在縊蟶7個組織中均有表達，且均在肝胰腺中表達量最高。經氨氮脅迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90的表達量均顯著上升，表明這2個基因均參與氨氮脅迫的應激反應，但高濃度氨氮脅迫或脅迫后期，其表達量下降，表明它們在肝胰腺中積極響應氨氮脅迫。研究結果為進一步研究氨氮對縊蟶的早期毒性作用和潛在應激機制奠定了基礎。

附錄

表A1 GST進化樹結構中使用的序列的登錄號Table A1 Accession numbers of the sequences used in GST phylogenetic tress

續表 A1

表A2 HSP90進化樹結構中使用的序列的登錄號Table A2 Accession numbers of the sequences used in HSP90 phylogenetic tress