軍曹魚（Rachycentron canadum）幼魚對環境低氧脅迫氧化應激與能量利用指標的響應

李洪娟，陳剛*，郭志雄，王維政，黃建盛*，曾澤乾

(1. 廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088)

1 引言

魚類的生命活動易受到各種環境因子的影響，水體溶解氧含量是其中重要的影響因子之一[1]。溶解氧作為維持水生動物生存的基本條件，它主要影響水生動物的生長、呼吸、物質和能量代謝等各種生理生化指標[2-4]。在自然因素和人為因素的影響下，近岸海域缺氧現象呈現出不斷上升的趨勢，造成水體周期性和連續性低氧的現象，且部分近岸海域在夏、秋季大多處在低氧狀態（溶解氧含量大約為3 mg/L），從而導致了大量魚類和海洋無脊椎動物的死亡，成為名副其實的“死水區”[5-8]。水生動物在低氧環境下，容易引起機體的應激反應，尤其是低氧脅迫后的復氧階段更加劇了應激反應，導致機體氧化損傷，產生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），最終影響其生理功能[9]。為了降低ROS對機體的損傷，生物體通過抗氧化酶體系來發揮抗氧化應激作用。同時，低氧會導致有氧代謝降低和無氧代謝增加，隨之能量代謝系統也會受到影響[10-11]。近年來研究表明，魚類通過增加呼吸效率、增加血氧親和力、改變代謝效率以及降低能量消耗等方式來應對低氧環境[9]。因此，研究低氧脅迫下魚類的氧化應激水平及其能量利用不僅為魚類適應低氧環境提供參考依據，還可以探討其在水產健康養殖中的意義。

軍曹魚（Rachycentron canadum）亦稱海鱺、海龍魚，隸屬于鱸形目（Perciformes）、軍曹魚科（Rachycentridae）、軍曹魚屬（Rachycentron），為海產名貴魚類，是南方沿海海水網箱養殖產業的重要組成部分，且對水體溶氧要求很高，一旦缺氧，將造成巨大經濟損失[12-13]。近年來，由于風和潮汐的作用，受水溫、季節、養殖密度等因素的影響，在軍曹魚養殖海區經常出現低氧現象。溶解氧的變化會引起機體氧化應激水平的改變，肝臟是機體對外界刺激反應最早、最敏感的組織之一，也是最早出現損傷的組織，嚴重時則會使魚類肝臟的解毒功能處于超負荷狀態[14]。同時，魚類為了延長自身的生存時間，會降低其運動能力，因此肝臟和肌肉組織的代謝情況也備受關注[15]。本實驗室已研究了急性低氧對軍曹魚大規格幼魚血液生化指標的影響[16]，而關于低氧及復氧對其氧化應激水平的影響尚未開展研究。為此，本實驗以軍曹魚幼魚為對象，研究低氧脅迫與復氧對其肝臟和肌肉組織氧化應激水平與能量利用的影響，探討軍曹魚對低氧環境的適應性，以期為軍曹魚的健康養殖提供參考資料。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗魚來源于廣東海洋大學水產學院魚類種子工程與養殖團隊在東海島生物研究基地繁育的幼魚，隨機選取健康、活力好的個體200尾用專用魚苗運輸車運回實驗室，幼魚的體質量為（220.67±20.73）g，全長為（29.37±3.76）cm。實驗在自制的室內循環水養殖系統中進行，水體交換量為90 L/h，水槽的長、寬、高分別為70 cm、50 cm和60 cm，每個水槽放20尾幼魚。暫養期間，通過調節水槽內的充氣量大小，保持水中溶解氧在6 mg/L以上，水溫為（26.3±2.5）℃，鹽度為 27.8±0.47，總氨氮含量為（0.17±0.03）mg/L。每日投喂石斑魚專用配合飼料2次（廣東越群海洋生物研究開發有限公司），及時清理糞便。實驗開始前一天停止投食。

2.2 實驗設計

實驗在循環水養殖系統中的6個水槽中進行，分為實驗組和對照組，各3個重復。對照組采用循環水養殖并始終保持持續充氣及流水狀態，用溶氧儀（臺灣衡欣，AZ8403）每隔10 min監測溶氧量的變化，對照組的溶氧量為（6.64±0.35）mg/L；實驗組通過調節循環水的流量、關閉充氣及水槽上方覆蓋薄膜的方法來降低水體溶解量，并用溶氧儀實時監測。當溶解氧為（2.64±0.25）mg/L條件下低氧脅迫維持3 h，取樣后，立即恢復常氧狀態，復氧后溶氧量為（6.34±0.15）mg/L，在復氧8 h，24 h和48 h后取樣，實驗組和對照組取樣時間一致。

2.3 樣品采集與制備

實驗處理后，實驗組在低氧脅迫與常氧恢復的各個時間點取樣，常氧對照組在實驗結束后取樣，每個時間點每桶各取3尾魚，將實驗魚用適量的200 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）海水溶液快速麻醉，用紗布擦干解剖，取其肌肉和肝臟組織，放置于1.50 mL凍存管中，迅速放于液氮中速凍，之后轉移至-80℃超低溫冰箱，保存待測。取肝臟和肌肉各0.60 g，按1∶9加入0.90%生理鹽水，在冰水浴中用勻漿機（IKA）勻漿5 min，制成10%勻漿液；之后在溫度4℃、轉速2 000 r/min的條件下，離心15 min；取上清液分裝后，置于-80℃保存，用于各酶活指標的測定。

2.4 酶活力測定

采用南京建成生物工程研究所檢測試劑盒測定組織中氧化應激和能量利用指標，包括丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、脂質過氧化物（Lipid Peroxide，LPO）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）以及乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和糖原。MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法，反應體系產生紅色產物，在532 nm波長處測其吸光度，計算轉換為MDA含量；GR采用紫外比色法，定義1 g組織蛋白1 min使反應體系中底物還原型輔酶Ⅱ（Triphosphopyridine Nucleotide，NADPH）的濃度改變1 mmol/L所需的酶量為一個酶活力單位；CAT采用鉬酸銨法，定義1 mg組織蛋白1 s分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位；GPx采用比色法，定義1 mg蛋白質，1 min扣除非酶反應的作用，使反應體系中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位；SOD采用羥胺法，定義1 mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率50%時所對應的SOD量為一個活力單位（單位U）；蛋白質濃度測定采用考馬斯亮藍法；LDH采用微板法，定義1 g組織蛋白37℃與基質作用15 min，反應體系中產生1 μmol丙酮酸為1單位；糖原采用比色法，利用糖原在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍生物，后者再與蒽酮作用形成藍色化合物，與同法處理的標準葡萄糖溶液比色定量。相應的操作步驟參照試劑盒說明書。

2.5 數據處理

實驗所得數據用平均值±標準差（mean±SD）表示。采用配對t檢驗方法分析對照組和低氧脅迫后的數據差異顯著性，以p＜0.05表示差異顯著，以p＜0.01表示差異極顯著；采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析對照組與恢復常氧不同時間點的數據差異顯著性，并用Duncan檢驗進行多重比較。

3 結果

3.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚氧化應激指標的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的氧化應激指標的影響見圖1。由圖1可知，低氧脅迫3 h后，肝臟MDA含量與對照組的差異具有統計學意義（t=6.675，df=2，p=0.022＜0.05），肌肉 MDA 含量與對照組的差異具有統計學意義（t=4.352，df=2，p=0.049＜0.05）（圖 1a）；肝臟LPO活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05），肌肉LPO活性比對照組降低了0.08 μmol/g，差異具有統計學意義（t=3.482，df=2，p=0.037＜0.05）（圖 1b）；肝臟CAT活性比對照組降低了4.81 U/mg，差異具有統計學意義（t=8.715，df=2，p=0.013＜0.05），肌肉 CAT 活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1c）；肝臟和肌肉GPx 活性均與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1d）；肝臟SOD活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05），而肌肉SOD活性與對照組差異具有統計學意義（t=5.027，df=2，p=0.037＜0.05）（圖 1e）；肝臟 GR 活性與對照組差異具有統計學意義（t=4.428，df=2，p=0.047＜0.05），肌肉 GR 活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1f）。

3.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚能量利用指標的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的能量利用指標的影響見圖2。由圖2可知，低氧脅迫3 h后，肝臟LDH活性比對照組升高了169.80 U/g，差異具有統計學意義（t=4.816，df=2，p=0.020＜0.05），肌肉 LDH 活性比對照組升高了177.90 U/g，差異具有統計學意義（t=3.845，df=2，p=0.031＜0.05）（圖 2a）；肝糖原含量比對照組降低了8.51 mg/g，差異具有統計學意義（t=22.14，df=2，p=0.002＜0.01），肌糖原含量比對照組降低了 1.41 mg/g，差異具有統計學意義（t=13.13，df=2，p=0.006＜0.01）（圖 2b）。

3.3 復氧過程對軍曹魚幼魚氧化應激指標的影響

圖1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應激指標的影響Fig. 1 Effects of hypoxic stress on oxidative stress indicator of liver and muscle of juvenile cobia

圖2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的乳酸脫氫酶活性、糖原含量的影響Fig. 2 Effects of hypoxia stress on lactate dehydrogenase activity and glycogen content in liver and muscle of juvenile cobia

表1 復氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應激指標的影響Table 1 Effects of reoxygenation on oxidative stress indicator of liver and muscle of juvenile cobia

復氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應激指標的影響見表1。由表1結果顯示，肝臟組織中，MDA含量恢復常氧8 h后與對照組無顯著差異（p＞0.05），24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；LPO活性在復氧 8 h、24 h和 48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；在復氧8 h、24 h和48 h過程中，CAT活性顯著高于對照組（p＜0.05），并且在24 h時CAT活性達到最大；復氧8 h、24 h和48 h后，GPx活性顯著高于對照組（p＜0.05），呈逐步增加趨勢，且在復氧24 h后達到最大值；在復氧8 h和24 h的過程中，SOD含量逐漸升高，且在復氧24 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；在復氧8 h、24 h和48 h過程中GR活性顯著高于對照組（p＜0.05）。肌肉組織中，MDA含量在復氧8 h和24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且逐漸升高，48 h 與對照組無顯著性差異；LPO活性在復氧8 h、24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且在復氧8 h時達到最大值，隨后逐漸降低；CAT活性在復氧24 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；GPx活性在復氧 8 h、24 h和 48 h后顯著高于對照組（p＜0.05），呈逐步下降趨勢，但未能降低到正常水平；SOD活性在復氧8 h、24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；GR活性在復氧8 h和24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且在復氧 24 h后，GR 活性達到最大值，復氧24～48 h階段GR活性逐漸下降，在復氧48 h后無顯著性差異。

3.4 復氧過程對軍曹魚幼魚能量利用指標的影響

復氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉能量利用指標的影響見表2。表2結果顯示，肝臟組織中，LDH活性在復氧8 h、24 h和48 h后，與對照組無顯著性差異（p＞0.05），隨著復氧時間的增加活性逐步降低，且恢復到正常水平；肝糖原含量在恢復氧氣24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），復氧48 h后顯著低于對照組（p＜0.05）。肌肉組織中，LDH 活性在復氧 8 h、24 h和48 h后無顯著性差異（p＞0.05）；肌糖原含量在復氧8 h、24 h和 48 h 后顯著低于對照組（p＜0.05）。

4 討論

正常狀態下，機體內的ROS處于一種不斷產生又不斷被清除的動態平衡狀態，而過多的ROS便會對機體造成一定的毒害，如MDA和LPO含量的變化。機體的抗氧化系統作為ROS的清除系統，主要包括SOD、CAT、GPx和GR，參與ROS的清除以及在機體的保護性防御反應中發揮巨大作用[1]。糖原是機體內最為重要的功能物質，對維持機體的能量代謝有重要作用。因此，實驗將從以下3個方面進行討論。

表2 復氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉能量利用指標的影響Table 2 Effects of reoxygenation on energy utilization indicator of liver and muscle of juvenile cobia

4.1 低氧脅迫與恢復對軍曹魚組織MDA和LPO含量的影響

機體受到低氧脅迫后，體內的ROS含量發生變化，從而引起機體抗氧化系統的變化[17]。MDA和LPO作為脂質過氧化的一種指標，其含量增加表明低氧脅迫對魚體產生了氧化損傷，影響魚類的生理功能[18]。本實驗中，在低氧脅迫3 h后，肝臟和肌肉中MDA含量顯著降低，肌肉LPO含量也顯著降低，這是因為在低氧脅迫下軍曹魚供氧受到限制，使氧氣經過線粒體呼吸鏈相應減少，那么線粒體產生的ROS也相應減少，這與對瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）的研究結果相似[1]。肝臟MDA含量在復氧24 h和48 h后顯著升高，且肌肉MDA含量在復氧8 h和24 h后顯著升高；肝臟和肌肉LPO活性在復氧8 h、24 h和48 h后均出現不同程度的升高，說明恢復溶氧后軍曹魚氧化應激反應較為強烈。這與對瓦氏黃顙魚和花鱸（Lateolabrax maculatus）的研究結果相似[1,9]。分析其原因可能由于軍曹魚在復氧過程中由于大量氧氣的導入，機體補償代謝更加劇了氧化應激脅迫，使得ROS的濃度迅速升高，導致生物大分子過氧化，如LPO和MDA含量升高，因而出現了復氧過程中更為強烈的氧化應激現象。

4.2 低氧脅迫與恢復對軍曹魚組織抗氧化酶活性的影響

低氧能夠影響魚體抗氧化防護能力，從而引起魚類產生氧化應激，其與抗氧化酶活性密切相關[19]。酶類抗氧化劑（如CAT、SOD、GPx和GR）可清除細胞內多余的氧自由基，來預防氧化應激對組織或細胞的損傷，從而維持機體的ROS平衡[20]。本研究中，肝臟和肌肉中GPx活力在低氧脅迫3 h后無顯著性差異，而肝臟CAT和GR活力顯著降低，肌肉SOD活力顯著升高，這與對細鱗肥脂鯉（Piaractus mesopotamicus）和葛氏鱸塘鱧（Perccottus glenii）的研究結果相似[21-22]。說明低氧脅迫3 h時，機體抗氧化酶體系未被完全激活，機體線粒體仍然可以在靜止狀態下呼吸，在一定程度上抵抗低氧脅迫或產生較少的ROS或存在代謝減痕作用，導致線粒體有氧呼吸減弱，減少了電子傳遞鏈上電子逃逸的幾率，以致氧攜帶電子減少，從而減少了ROS的生成，主要的原因可能是低氧脅迫下魚類的耐受性較高，且低氧脅迫的時間較短[23]。在復氧8 h、24 h和48 h階段，肝臟和肌肉中CAT、SOD、GPx和GR活性均出現不同程度的升高。肝臟CAT、SOD和GPx活性在復氧24 h后達到最大值，而在復氧24～48 h階段，其活性逐漸下降，但未能恢復到正常水平；在復氧過程中，肌肉SOD和GPx活力沒能恢復到正常水平，這與花鱸和鯔魚（Mugil cephalus）的研究結果相似，恢復溶氧后其氧化應激反應仍然較為強烈[9,14]，說明在缺氧后再復氧的過程中，ROS在組織或細胞內快速蓄積，過量的ROS造成魚體氧化應激和抗氧化體系的紊亂，從而使軍曹魚體內的抗氧化防御機制在缺氧后再復氧的過程中被完全激活。綜上所述，魚類在低氧脅迫下氧化應激參數變化各異，表明機體能夠提高自身的抗氧化潛能，從而為解決再氧化后體內的氧化應激做好準備[1]。本研究中氧化損傷指標（MDA和LPO）和能量利用指標（LDH和糖原）也證實了這一結論。

4.3 低氧脅迫與恢復對軍曹魚能量利用的影響

機體正常生命活動的運行需要能量來維持。糖原是機體內最為重要的供能物質，對維持機體的能量代謝有重要作用[24]。而LDH可以催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉化，為生命活動提供能量，是魚類機體無氧代謝的標志酶，其活力大小在一定程度上反映了無氧代謝能力的高低[25]。

本實驗中，在急性低氧脅迫3 h后，肝臟和肌肉中糖原含量急劇下降，LDH含量急劇上升，表明機體由于氧氣不足進行了無氧代謝，動用糖原中貯存的能源物質來維持其基本代謝，同時LDH活力升高，將更多的丙酮酸轉化為乳酸，乳酸濃度升高表示厭氧糖酵解反應加劇，以應對突然出現的低氧環境[14,26]，與對白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）的研究結果一致[24,27]。復氧過程中，肝臟和肌肉LDH含量呈現相反的變化趨勢，但在復氧48 h后，其LDH含量均與對照組無顯著性差異；肌糖原含量顯著降低。這說明盡管機體的代謝水平隨著復氧時間的增加而逐漸恢復，但仍需部分厭氧糖酵解產生ATP為機體供能，這與大彈涂魚（Boleophthalmus boddaerti）和梭魚（Liza haematocheila）的研究結果相似[28-29]。已有研究顯示，魚類的白肌組織是乳酸產生和清除的主要部位[30]，本實驗說明軍曹魚肌肉具備一定的厭氧代謝能力，可以通過厭氧代謝提供能量，從而使LDH和糖原含量維持在一定的范圍內，有利于減少肝臟等重要器官的損傷，也有利于提高軍曹魚適應低氧環境的能力。

5 結論

低氧脅迫與恢復對軍曹魚機體的氧化應激和能量利用有顯著的影響。在低氧脅迫階段，軍曹魚幼魚抗氧化酶活力存在顯著差異，無氧代謝增加；在復氧階段，不同組織的抗氧化應激能力不同，且肝臟在抗氧化應激防御體系中發揮重大作用。隨著復氧時間的增加，機體能量供應能夠通過自身的生理調節逐漸恢復到正常水平，說明軍曹魚具有一定的抗逆性。

致謝：感謝廣東海洋大學水產學院2017級曹勤、曹丹煜及2018級鄺杰華、蔡潤佳、黃寶松、毛非凡、鄧文鑫在樣品采集中給予的幫助。