豬TLR4基因SNP位點篩選及生物信息學分析

王馨敏，朱喬峰，馬 越，秦雅晶，李之昂，劉麗霞

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

Toll樣受體（TLRs）是動物體中重要的模式識別受體，在免疫細胞表層，例如淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞等廣泛存在[1]，在非免疫細胞，例如上皮細胞、牛胚氣管細胞等中具有較強的活性[2]。TLR4基因是20世紀末期才被發現的一種重要基因，屬于TLRs受體家族的成員，具有一型跨膜蛋白結構，由胞內區、胞外區、跨膜區三個部分組成，胞外區具有大量的亮氨酸重復序列，組成了多肽鏈兩個末端之一的N端。TLR4是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）中比較典型的模式識別受體，在指導和編碼合成細胞壁外膜內毒素成分時具有重要作用，與革蘭氏陰性菌感染的致病機理具有密切聯系。TLR4作為一種跨膜信號受體直接將脂多糖產生的刺激信號傳入細胞內，是革蘭氏陰性菌及其脂多糖進行宿主反應的重要媒介，與各種炎癥因子基因的表達有關[3]。

豬作為重要的實驗動物資源之一在我國具有豐富的品種，具有遺傳性狀穩定、對近交耐受性強、品種多等特點。研究發現，TLR4基因突變會對受體的信號轉導作用和機體的抗病性、易感性產生影響[4]。潘章源等[5]（2011）在進行野豬和國內10個地方豬品種TLR4外顯子1時，發現了高度保守的特征，不同品種豬基因外顯子1存在顯著差異。朱衛華等[6]（2014）對安徽地方豬霍壽黑豬和引進豬種長白豬TLR4基因進行多態性分析，研究發現外顯子3具有一個突變位點，多態性在地方豬品種和引進豬品種之間存在差異性。黃麗麗等[7]（2019）對海南五山豬TLR4基因進行克隆和生物信息學分析時發現，該品種豬該基因的蛋白具有分泌性蛋白和跨膜蛋白，呈現親水性。TLR4基因具有較高保守性，但其變異會對受體的信號傳遞產生影響，與機體的易感性和疾病抗性有關。

本研究以大白豬、長白豬、杜洛克豬、八眉豬四個品種的豬作為實驗開展的研究對象，實驗過程中需要構建DNA混合池，并對混合池結果進行PCR擴增，通過這種方式對產物進行直接測序的方式對各種豬TLR4基因部分編碼區（Coding regions， CDS）的SNP位點進行分析和篩選，還進行了生物信息學分析，為TLR4基因易感性和疾病抗性的進一步研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 采集樣本

從豬種豬場通過隨機抽樣的方法選取大白豬、長白豬、杜洛克豬和八眉豬各50頭，采集仔豬耳組織各約2 g，置于75%酒精中，-20℃冷凍保存備用。

采用試劑盒的方式提取不同樣品豬種的DNA，并在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上進行DNA樣品純度的檢測，并篩選提取效果良好的基因組DNA樣品構建DNA混合池，即取50個DNA樣品進行混合。

1.2 引物的設計與合成

參照G e n B a n k上公布的豬T L R 4基因序列（登錄號：A B 2 3 2 5 2 7.1），使用P r i m e r P r e m i e r 5.0軟件設計特異性引物。T L R 4基因的引物設計F:5′-CGTCATTAGTGCGTCAGTTCTC-3′R:5′-GAGCCGATGGTGTATCTTTGAG-3′，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 TLR4基因的PCR擴增和測序

以DNA混合池為模板擴增TLR4基因，摸索出最佳的擴增體系及條件。

50個同品種的豬基因樣品各吸取1μl放入同一個離心管中構建DNA混合池，把DNA混合池作為PCR擴增的模板。PCR擴增體系為：DNA模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×Power Taq PCR Master Mix10μl，加ddH2O 7μl。

PCR反應過程：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃30 s，退火58.1 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 50 s，循環30次；最后延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，當檢測結果良好時送生物技術服務公司純化后進行雙向測序。

1.4 測序結果分析

利用Editseq和MEGA6.0等軟件將原基因序列與測序結果放在一起，進行拼接和對比分析，對SNP位點進行篩選，并利用生物信息學分析軟件進行序列特征分析。

1.5 實驗過程中應用的生物信息學分析軟件

對TLR4基因片段CDS編碼產物進行生物信息學分析時重點分析：氨基酸序列、蛋白質特性及功能結構域等，需要應用的工具軟件與網址見表1[8]。

表1 豬TLR4基因生物信息學主要分析軟件

2 結果分析

2.1 豬TLR4基因PCR擴增結果及測序結果

通過PCR擴增的方法對豬TLR4的基因片段進行檢測，得到對應片段的測序結果。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，結果顯示引物的特異性良好，PCR產物只有一條條帶。基因片段的大小為353 bp，電泳結果與預期結果相符（見圖1）。

利用MEGA6軟件、BioEdit軟件將原基因序列與測序結果放在一起進行拼接和對比分析，并篩選SNP位點，結果顯示豬TLR4基因片段中不含有SNP位點。

圖1 TLR4基因擴增電泳結果

2.2 豬TLR4基因編碼蛋白質理化性質的分析和預測

蛋白質的理化性質包括蛋白質的相對分子質量、半衰期、等電點等，通過Bioedit及Lasergene7.1軟件對豬TLR4基因片段編碼蛋白質理化特性進行分析（見表2）。豬TLR4基因片段一共編碼118個氨基酸，纈氨酸（Val）最多，占整個氨基酸組成的12.7%，甲硫氨酸（Met）含量為0（見圖2）。豬TLR4基因編碼產物不穩定指數為50.67，大于40，所以說明該基因編碼產物具有穩定性。

表2 TLR4基因編碼蛋白質理化性質

圖2 20種氨基酸所占比例

2.3 豬TLR4基因編碼蛋白質疏水性/親水性預測和分析

運用Expasy服務器上的Protscale程序對豬TLR4基因編碼蛋白質的疏水性和親水性進行預測（見圖3），結果顯示該蛋白質第15位疏水性最強（2.811），第55位親水性最強（-2.867）。整個編碼產物中，親水氨基酸占39.84%，疏水氨基酸占60.16%，親水性平均值（GRAVY）為0.385，表明該基因編碼的蛋白質呈現疏水性，由此可推斷豬TLR4基因編碼的蛋白質是一種不溶性蛋白質。

圖3 豬TLR4基因編碼蛋白質的疏水性/親水性預測

2.4 豬TLR4基因編碼蛋白質二級結構和三級結構預測與分析

運用在線程序（DNA fold web server 服務器）預測參考序列（登錄號：AB232527.1），對豬TLR4基因編碼蛋白質的二級結構進行預測（見圖4）。運用在線設計程序進行同源建模，對蛋白質的三級結構進行預測，結果顯示三級結構也具有α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲，與二級結構相符（見圖5）。

圖4 豬TLR4基因編碼蛋白質二級結構預測

圖5 豬TLR4基因編碼蛋白質三級結構預測

3 討論

生物個體的表現形式由基因和外界環境共同決定[9]，進行豬抗病性狀、生產性狀的研究具有重要意義，現階段受到商品化導向的影響，不同品種豬的抵抗力和體質都在下降，致使一些與抗病性有關的等位基因出現丟失[10]。TLR4基因是一種與免疫系統有直接聯系的重要基因，研究表明基因多態性與動物對病原的免疫能力有關[11]。近些年，開展不同品種豬TLR4基因研究工作的人越來越多，主要集中于抗病性、多態性和免疫方面[12-15]。劉筱等[16]在研究過程中發現該基因編碼蛋白質LRR（富含亮氨酸重復序列）功能域上的突變可能與豬種對疾病的易感性不同有關。王會敏等[17]對綿羊TLR4基因多態性與布魯氏菌病易感性進行分析，發現TLR4基因只有1 180 G/T位點可能與綿羊的布魯氏菌病易感性有關。基于模板的蛋白結構預測計算預測蛋白質三維結構的重要方法是以模板為基礎的蛋白質結構預測，具有快速、高準確性的特點[18,19]。本實驗在進行蛋白質結構預測時借助同源建模的在線設計軟件完成。

構建DNA混合池進行目的片段擴增是一種簡單又直接的測序方法，可以發現基因的功能并指導抗病育種。本研究運用DNA混合池對TLR4基因的2 912～3 240片段進行擴增，該區域中沒有發現SNP位點。

在進行蛋白質理化特性預測和蛋白質疏水性/親水性分析時，發現基因片段一共編碼118個氨基酸，纈氨酸（Val）最多，甲硫氨酸（Met）最少，基因編碼產物不穩定大于40，說明基因編碼產物具有不穩定性。編碼蛋白質片段的親水性平均值（GRAVY）為0.385，說明該基因編碼的蛋白質呈現疏水性，所以豬TLR4基因片段編碼的蛋白質是一種不溶性蛋白質。進行蛋白質二級、三級結構的預測能夠反映出蛋白質氨基酸序列與蛋白質空間結構的關系，為該基因編碼蛋白質的結構與功能研究提供理論依據。現階段蛋白質結構預測在分子生物學的中心法則中還不能被合理的解釋，對蛋白質具體功能的分析還需要進行深入研究。