IL-4、VCAM-1、VEGF與VEGFR2在MDCK細胞中的表達分布

冶 金，楊 琨，阿依木古麗，喬自林，柏家林＊

（1．西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2．西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3．西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

犬腎傳代細胞系（Madin Darby canine kidney，MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織中分離培育建立，是通常以貼壁方式培養的上皮樣細胞[1,2]。MDCK細胞廣泛應用于呼腸弧病毒、腺病毒和禽流感病毒等多種病毒的分離、純化及擴增，對于不同流感病毒株的普遍敏感性使MDCK細胞被公認為是適于流感疫苗生產的重要細胞基質之一[3-5]。目前，國外已有多家公司生產的MDCK細胞基質流感疫苗獲得美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證批準上市[2,6]，而國內的流感疫苗生產則還處于傳統的雞胚生產，主要是因為MDCK細胞成瘤安全性問題。白介素4（Interleukin 4，IL-4）、血管內皮細胞粘附因子（VCAM-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子受體（VEGFR2）是四種不同的細胞因子[7-11]，均與細胞成瘤過程相關。本文通過應用免疫組化SP法檢測MDCK細胞中IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四種細胞因子蛋白的表達及分布狀況，為研究MDCK細胞內源性蛋白表達及功能作用提供數據支持，為探究四種細胞因子蛋白與MDCK細胞成瘤性之間的聯系奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：MDCK貼壁細胞（P-63），由甘肅省動物細胞創新中心提供。主要試劑：新生牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶和PBS緩沖液，購自蘭州百靈生物技術有限公司；組織細胞固定液（4%多聚甲醛），購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化染色試劑盒、Rabbit Anti-IL4l1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VCAM-1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGF Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGFR2 Polyclonal Antibody，購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒和蘇木素染液，購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及傳代 從液氮中取出細胞凍存管，置于37℃水浴中快速晃動融解凍存管中細胞懸液，將細胞懸液接種至含有20 ml新鮮DMEM（含10% 新生牛血清）培養基的T-25細胞瓶中，吹打均勻后置于37℃，5% CO2培養箱中靜置培養。為減小DMSO 對細胞的損傷，在細胞培養4～8 h內更換新鮮培養基。

1.2.2 細胞爬片制備 胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養基中，充分吹打使之成單細胞懸液，計數；將蓋玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的密度將單細胞懸液接種于6孔板中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養過夜。

1.2.3 免疫組化SP法染色 取出細胞爬片，用PBS緩沖液輕洗細胞5 min；加入組織細胞固定液（4%多聚甲醛）室溫固定細胞20 min；加入0.5% Triton X-100（PBS緩沖液配制）浸泡20 min；滴加3% H2O2室溫孵育15 min以消除內源性過氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育15～20 min，傾去；滴加適當比例的一抗上，37℃ 孵育2 h或4℃過夜孵育；PBS緩沖液沖洗3遍；滴加生物素化二抗工作液，37℃或室溫孵育15～20 min；PBS緩沖液沖洗3遍；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育15～20 min；PBS緩沖液沖洗3遍；DAB 顯色，鏡下觀察適時終止（自來水沖終止）；自來水沖洗，蘇木素復染室溫30 s；自來水沖洗返藍15 min；梯度酒精脫水；二甲苯透明后用中性樹膠封片。

2 結果

在上述實驗結果圖中，MDCK細胞核著色為藍色；IL-4（見圖1）、VCAM-1（見圖2）、VEGF（見圖3）、VEGFR2（見圖4）四種蛋白結合其對應的抗體著色為褐色，褐色深淺表現蛋白在細胞中的表達強弱，實驗陰性對照（見圖5）只對MDCK細胞的細胞核進行染色。IL-4在MDCK細胞中著色均一，在胞核及胞質中均有表達，呈彌漫性分布，定位于MDCK細胞胞漿中；VCAM-1、VEGF和VEGFR2則都呈片塊性分布，在胞膜及胞質中表達，且VCAM-1、VEGF和VEGFR2均為胞膜強于胞質中表達，定位于MDCK細胞胞膜上。

圖1 IL-4在MDCK細胞中的染色

圖2 VCAM-1在MDCK細胞中的染色

圖3 VEGF在MDCK細胞中的染色

圖4 VEGFR2在MDCK細胞中的染色

圖5 MDCK細胞陰性對照染色

（圖1、圖2、圖3、圖4分別為IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2蛋白在MDCK細胞中的染色結果；圖5為陰性對照，只對MDCK細胞核進行染色，標尺均為20 μm）

3 討論

IL-4是由Th2型細胞分泌的一種糖蛋白，是一種多效應細胞因子，同時研究發現IL-4參與細胞成瘤進程并抑制腫瘤免疫[12,13]；VCAM-1為血管內皮細胞粘附因子，分布于細胞表面或細胞外基質中，其表達強弱與腫瘤細胞遷移與擴散有關[14]；VEGF為血管內皮細胞生長因子、VEGFR2為血管內皮細胞生長因子受體，均與腫瘤細胞生長有關[15]。目前國外已有基于MDCK細胞生產的人用流感疫苗相繼上市[16]，而國內目前還處于臨床試驗階段，MDCK細胞作為疫苗生產用細胞系，其成瘤性密切關聯疫苗質量安全問題。已驗證IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四種細胞因子蛋白在MDCK細胞中表達及分布，但是否影響MDCK細胞成瘤還需進一步研究。