結腸癌組織中TBX3及增殖、凋亡、自噬相關基因表達觀察

董明杰，周艷，段沫，高慶敏，趙建輝

1 河北醫科大學第二醫院，石家莊050000；2 正定縣人民醫院

隨著分子生物學的發展，分子靶向治療和基因治療為惡性腫瘤患者帶來了新的希望，有效生物標志物也在惡性腫瘤的早、中期檢測及預后臨床管理中起著重要作用。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，由于其發病較為隱匿、沒有特異性癥狀，部分結腸癌患者一經發現即處于中、晚期階段，因此有必要尋找新的生物標志物，從而更準確、全面的開展結腸癌患者精準治療。TBX基因家族是調控發育相關轉錄因子基因家族，TBX3基因是TBX基因家族成員之一[1,2]。研究[3～5]顯示，TBX3基因在細胞惡變及腫瘤的形成過程中發揮重要作用。研究[4,6]表明，TBX3基因在乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌等腫瘤組織中表達異常增高。Shan等[7]報道，結腸癌組織中TBX3蛋白的表達明顯高于正常組織。但TBX3調節結腸癌發展的特定分子機制尚需進一步研究。本研究觀察了結腸癌組織中TBX3及增殖、凋亡、自噬相關基因的表達，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月～2018年9月河北醫科大學第二醫院收治并接受手術治療的結腸癌患者68例，男41例、女27例，平均年齡(54.86±12.05)歲，術中留取癌組織及癌旁組織標本，分別記為觀察組、對照組，各組標本在-80 ℃條件下保存。患者術前均未行放化療或靶向治療。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑及引物 TBX3基因小鼠抗人單克隆抗體、內參β-actin購自Santa Cruz公司，增殖細胞核抗原(PCNA)基因、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)基因、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因、基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)基因、細胞凋亡相關基因-2(Bcl-2)基因、Bcl-2相關X蛋白(Bax)基因、半胱天冬酶-3(Caspase-3)基因、存活蛋白(Survivin)基因、肽基脯氨酰順反異構酶1(Pin1)基因、神經元衍生的孤核受體(NOR1)基因、自噬基因同源家族成員(ARHI)基因、自噬調節蛋白(Beclin1)基因、組織蛋白酶-D(Cathepsin-D)基因引物及內參基因GAPDH引物由上海生工生物技術公司合成。

1.3 觀察組、對照組TBX3蛋白的檢測 采用Western blotting法。取結腸癌組織及癌旁組織100 mg，細胞裂解液裂解，Bradford法測定組織細胞總蛋白，在50 μg總蛋白液中加入聚丙烯酰胺凝膠緩沖液，水浴3～5 min進行蛋白變性，上樣、凝膠電泳分離，半干法轉移至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉、加入一抗孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育反應，充分洗膜后顯影曝光，對條帶進行吸光度掃描，以TBX3/β-actin比值表示TBX3蛋白的相對表達量。以觀察組TBX3蛋白相對表達量的中位數為界，將其分為高TBX3表達組、低TBX3表達組。

1.4 觀察組、對照組TBX3基因和高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組增殖相關基因(PCNA基因、MMP-2基因、MMP-9基因、TIMP-1基因)、凋亡相關基因(Bcl-2基因、Bax基因、Caspase-3基因、Survivin基因、Pin1基因、NOR1基因)、自噬相關基因(ARHI基因、Beclin1基因、Cathepsin-D基因)mRNA的檢測 采用實時熒光定量PCR法。取結腸癌組織及癌旁組織100 mg，PCR試劑盒提取總RNA，Nanodrop 2000分光光度計鑒定其濃度和純度，用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行Real time PCR擴增。受檢基因PCR反應引物序列見表1。PCR反應條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，40個循環。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達量，比較高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組增殖、凋亡、自噬相關基因mRNA的相對表達量。

表1 受檢基因引物序列

2 結果

2.1 觀察組、對照組TBX3 mRNA和蛋白相對表達量比較 觀察組TBX3 mRNA和蛋白相對表達量分別為3.62±0.77、0.66±0.13，對照組TBX3 mRNA和蛋白相對表達量分別為0.92±0.14、0.18±0.03，兩者相比，P均<0.05。以觀察組TBX3蛋白相對表達量的中位數為界進行分組，其中高TBX3表達組34例、低TBX3表達組34例。

2.2 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組增殖相關基因mRNA相對表達量比較 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組增殖相關基因mRNA相對表達量比較見表2。由表2可知，高TBX3表達組、低TBX3表達組PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，TIMP-1 mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達組MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量均高于低TBX3表達組(P均<0.05)，TIMP-1 mRNA相對表達量低于低TBX3表達組(P<0.05)。

表2 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組增殖相關基因mRNA相對表達量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達組相比，﹟P<0.05。

2.3 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組凋亡相關基因mRNA相對表達量比較 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組凋亡相關基因mRNA相對表達量比較見表3。由表3可知，高TBX3表達組、低TBX3表達組Bcl-2、Pin1 mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)，Bax、Caspase-3、Survivin、NOR1 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達組Bcl-2、Pin1 mRNA相對表達量均低于低TBX3表達組(P均<0.05)，Bax、Caspase-3、Survivin、NOR1 mRNA相對表達量均高于低TBX3表達組(P均<0.05)。

表3 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組凋亡相關基因mRNA相對表達量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達組相比，﹟P<0.05。

2.4 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組自噬相關基因mRNA相對表達量比較 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組自噬相關基因mRNA相對表達量比較見表4。由表4可知，高TBX3表達組、低TBX3表達組ARHI、Beclin1 mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)，Cathepsin-D mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達組ARHI、Beclin1 mRNA相對表達量均低于低TBX3表達組(P均<0.05)，Cathepsin-D mRNA相對表達量高于低TBX3表達組(P<0.05)。

表4 高TBX3表達組、低TBX3表達組、對照組自噬相關基因mRNA相對表達量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達組相比，﹟P<0.05。

3 討論

TBX基因家族也稱T-box家族，是調控發育相關轉錄因子基因家族，根據結構及功能的相似度分為5個亞家族，即Brachyury、T-brain、TBX1、TBX2和TBX6亞家族，其中TBX2亞家族由TBX3基因與TBX2基因共同組成。不同的T-BOX亞家族成員有不同的組織表達特異性，在胚胎發育調控及維持干細胞功能過程具有重要功能[8]。

TBX3在心、腎、肺、肝、骨骼肌、胰腺和乳腺等多種器官均有表達。研究[9,10]發現，乳腺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、肉瘤和宮頸癌等多種癌癥患者的腫瘤組織中TBX3高表達，參與腫瘤發生的多種生物學行為，其中TBX3在乳腺癌方面的研究相對較多。研究[11，12]表明，TBX3不但參與了乳腺的發育調控，還參與了乳腺癌的形成和進展，對乳腺癌患者治療方案的制訂及預后的判斷有重要意義。

全基因組薈萃分析[13]指出，TBX3可能參與了結腸癌的發生發展。本研究中，我們采用Western blotting方法檢測結腸癌組織和癌旁組織中TBX3蛋白的表達，結果表明結腸癌組織種TBX3蛋白相對表達量明顯高于癌旁組織，提示TBX3蛋白可能參與結腸癌的發生發展。我們以結腸癌組織中TBX3蛋白相對表達量的中位數為界，對結腸癌患者進行二次分組，分為了高TBX3表達組和低TBX3表達組，進一步采用RT-PCR方法檢測增殖、凋亡、自噬相關基因mRNA的表達，結果表明高TBX3表達組、低TBX3表達組PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量均高于對照組，TIMP-1 mRNA相對表達量均低于對照組；高TBX3表達組MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量均高于低TBX3表達組，TIMP-1 mRNA相對表達量低于低TBX3表達組，提示了結腸癌患者增殖基因異常表達，TBX3蛋白高表達可加劇增殖基因表達紊亂，促進結腸癌細胞增殖。研究[14～16]顯示，Bax、Caspase-3、Survivin屬于凋亡相關調控基因，表達異?？梢种颇[瘤細胞凋亡，促使細胞向惡性轉化。研究[17]發現，抑制Pin1基因表達可抑制肺癌、宮頸癌、結腸癌等細胞凋亡。本研究結果提示，TBX3蛋白高表達可促進結腸癌細胞凋亡異常。自噬相關基因與腫瘤的關系密切，ARHI、Beclin1在惡性腫瘤中表達下降[18,19]，Cathepsin-D呈現高表達，并與腫瘤局部浸潤程度呈正相關[20]。本研究結果也證明了結腸癌患者ARHI、Beclin1 mRNA表達降低，Cathepsin-D mRNA表達升高，且高TBX3表達組與低TBX3表達組也有顯著差異，說明高表達的TBX3蛋白可進一步破壞自噬基因的正常表達，增加結腸癌惡性程度。

綜上所述，TBX3基因和蛋白在結腸癌組織中高表達，結腸癌組織中增殖、凋亡、自噬相關基因的表達與TBX3蛋白的高表達有關，TBX3基因有望成為結腸癌的新標志物。