海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚肉凍融穩(wěn)定性的影響

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(1.大連工業(yè)大學,國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧大連 116034; 2.衢州鱘龍水產食品科技開發(fā)有限公司,浙江衢州 324002)

鱘魚(Acipensersinensis)為冷水性魚類,是淡水魚類中個體最大、壽命最長的魚,是水中的活化石。鱘魚的主要產品是鱘魚子醬,其副產物的利用較低。鱘魚除了體表骨板外,其他部分都可食用,且鱘魚骨刺少[1],鱘魚肉中氨基酸含量均衡,蛋白質含量較高[2],非常適合加工。但在凍結貯藏過程中除了易發(fā)生冰晶的長大外,由于儲藏、運輸、加工和銷售等環(huán)節(jié)中溫度的不穩(wěn)定,會出現(xiàn)反復凍融的現(xiàn)象,造成蛋白質變性和脂肪氧化,導致以鱘魚肉為主的深加工產品非常少。很多研究表明也反復凍融會造成水產品品質的下降,Soottawat等[3]發(fā)現(xiàn)反復冷凍-解凍循環(huán)波動會造成鱈魚蛋白質嚴重變性;Boonsymrej等[4]指出隨著凍融次數的增加,蝦肉的鈣離子ATP酶(Ca2+-ATPase)活力明顯降低,肌纖維斷裂;反復凍融會使魚肉中的細胞受到機械損傷,蛋白質變性,解凍時汁液流失量增加,促使脂肪氧化,風味和營養(yǎng)價值下降[5-6],目前添加抗凍劑被認為是防止水產品冷凍變性的最有效的方法之一。

海藻糖理化性質穩(wěn)定,在人體內易被酶降解為葡萄糖而被人體吸收利用,作為一種新型的抗凍保護劑近年來已用于水產品保藏中[7],有研究表明,海藻糖在生物保護作用比其他糖類具有優(yōu)越性的主要原因是海藻糖具有優(yōu)越的玻璃態(tài)轉變溫度(Tg)值,且海藻糖的抑制冰晶的增長速率和冰晶形態(tài)學不穩(wěn)定性比蔗糖更有效[8-9]。蘇趙等[10]通過測定凍藏12周冷凍魚糜的鹽溶性蛋白、總巰基、Ca2+-ATPase活力發(fā)現(xiàn)添加6%的海藻糖能最大程度抑制蛋白質變性,且魚糜凝膠超微三維網裝結構更為緊實。為了強化魚類制品的抗凍效果,一般在添加糖類抗凍劑的同時,都會加入復合磷酸鹽進行復配[5],單獨使用磷酸鹽對抑制蛋白質冷凍變性的效果并不明顯[11],而復合磷酸鹽具有調節(jié)pH、乳化、緩沖、螯合金屬離子等功能,能夠提高肉制品質地、風味和嫩度[12]。以上研究表明海藻糖與復合磷酸鹽分別對魚肉有抗凍變性的效果,但目前海藻糖與復合磷酸鹽同時對魚類制品抗凍效果的研究很少,對其在防止鱘魚肉冷凍變性的應用研究更鮮有報道。

本研究為了強化鱘魚肉的抗凍效果,將不同濃度的海藻糖和復合磷酸進行復配,以持水性、蒸煮損失率、硫代巴比妥酸(TBARS)值、Ca2+-ATPase活力為指標,并結合掃描電鏡探究復合抗凍劑對鱘魚肉經反復凍融后魚肉品質的影響,為鱘魚肉冷凍調理食品的加工和開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凍藏雜交海博瑞鱘魚排(達氏鰉和施氏鱘的雜交品種,野生資源分布在中國黑龍江,本研究鱘魚來源于杭州千島湖養(yǎng)殖基地,魚齡8年,體重40 kg左右,打撈月份為每年3～6月份和9～12月份) 衢州鱘龍水產品科技開發(fā)有限公司,-20 ℃冷庫貯藏;海藻糖 食品添加劑,德州惠陽生物科技有限公司;復合磷酸鹽(三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉、焦磷酸二氫二鈉、磷酸三鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉) 食品添加劑,天富(連云港)食品配料有限公司;三氯乙酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;硫代巴比妥酸 生化試劑(BC),國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇 分析純,上海生工生物股份有限公司;鹽酸 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;超微量Ca2+-ATPase測試盒(型號A070-4) 南京建成生物工程研究所。

CF16RXII高速冷凍離心機 日立(HITACHI);HH-4型數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司;BQPJ-1切片機 嘉興艾博實業(yè)有限公司;200型電子天平 美國雙杰兄弟有限公司;UV5200紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;M200型酶標定量測定儀 瑞士Tecan Infinite公司;S8020掃描電鏡 日本Hitachi High-technologies公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 凍藏鱘魚排室溫解凍,利用切片機將魚排切成長寬厚為4 cm×3 cm×3 mm大小的魚片,然后分別用2.5%、5.0%海藻糖溶液和2.0%、3.0%復合磷酸鹽溶液進行復配;按照料液比=1∶1 (g/g)的比例,在0～4 ℃下浸泡60 min,然后在0～4 ℃下將水分瀝干,魚片用保鮮膜包裹后放于-20 ℃冰柜貯藏24 h,用于測定凍融后的持水性、蒸煮損失率、Ca2+-ATPase活力特性、TBARS值和掃描電鏡。

1.2.2 持水力測定 參照朱瑞麒[6]方法,將凍融后的鱘魚片用濾紙包裹,用離心機在3590×g,10 ℃下離心15 min,稱重W1。每組樣品測定4次,取平均值。計算公式如下:

式中:WHC表示持水率,%;W0表示樣品的原始質量,g;W1表示樣品離心后的質量,g。

1.2.3 蒸煮損失率測定 將凍融后的鱘魚片放入包裝袋中,在75 ℃水浴鍋中蒸煮15 min。蒸煮后流水冷卻到室溫,用吸水紙將鱘魚肉表面水分吸干,稱重記為W2。每組樣品測定4次,取平均值。計算公式如下:

式中:CL表示蒸煮損失率,%;W0表示樣品的原始質量,g;W2表示吸水后的質量,g。

1.2.4 TBARS值測定 準確稱取凍融1、3、5次的5.00 g碎鱘魚肉樣品,加入25 mL含有15%的三氯乙酸、0.375%的硫代巴比妥酸、0.25 mol/L鹽酸的溶液,混合均勻,在沸水浴中加熱20 min,待溶液變成粉紅色,置于流水中冷卻,然后5000 r/min離心20 min,取上清液于538 nm處測吸光度值,以蒸餾水替代樣品作空白對照。每組樣品測定4次,取平均值。TBARS值根據下面公式計算[13]:

TBARS=7.8×A

式中:TBA以mg(丙二醛)/kg樣品計,A表示吸光值。

1.2.5 Ca2+-ATPase活性測定 Ca2+-ATPase活力測定根據超微量Ca2+-ATP酶測試盒說明書進行測定。ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷,測定無機磷的量可判斷ATP酶活力的高低。以每小時每毫克鱘魚肉組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。即微摩爾磷/毫克蛋白/小時(μmol Pi/mgprot/h)。每組樣品測定4次,取平均值。

1.2.6 掃描電鏡分析 分別取凍融1、3、5次的樣品,用刀片切成3 mm左右厚的小薄片,然后放入密封的小玻璃瓶中,加入2.5%戊二醛溶液,溶液沒過樣品,然后將樣品放入0～4 ℃車載冰箱浸泡48 h,用清水清洗樣品,再用10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液清洗,最后用無水乙醇浸泡。然后使用CO2臨界點干燥儀進行置換,最后使用掃描電鏡觀察。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010進行實驗數據統(tǒng)計分析。數據結果為均值±標準差(Mean±SD),采用SPSS 22.0軟件(IBM公司)進行顯著性分析(P<0.05表示具有顯著性差異)。采用OriginPro 8.5軟件(OriginLab公司)進行作圖。

2 結果與分析

2.1 海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚反復凍融后持水性的影響

由圖1可以看出,所有組別的鱘魚肉在凍融1、2次后其持水性呈下降趨勢,但趨勢緩慢,在凍融4、5次后持水性顯著降低(P<0.05)。經過海藻糖和磷酸鹽溶液處理過的鱘魚肉的持水性下降趨勢較對照組緩慢,經過5.0%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽溶液浸泡過的鱘魚肉在整個凍融過程中,其持水性能顯著高于(P<0.05)未經處理的鱘魚肉。魚肉的持水性在凍融1、2次后下降緩慢,在凍融4、5次之后顯著下降可能是因為冰晶的形成及生長使細胞膜和組織結構受到機械損害,在解凍初期過程中,肌纖維結構還能維持完整,能吸收一部分解凍后的水分,在凍融后期,隨著冰晶的重新形成,肌纖維受到的破壞作用加劇,可能不能再吸收解凍后的水分,持水能力劇烈下降[14]。而經過海藻糖和磷酸鹽溶液處理過鱘魚肉的持水性較對照組高可能是因為海藻糖和磷酸鹽能延緩肉蛋白質冷凍變性,因為持水力的下降除了跟肌纖維細胞被冰晶的破壞有關,也與肌肉蛋白質的變性有關[15],而磷酸鹽可增加肉的離子強度,提高肉制品的pH,螯合肌肉蛋白中Ca2+、Mg2+,解離肉中的肌球蛋白來提高肉的持水性[16];也有研究指出復合磷酸鹽能使蛋白質分子的空間結構增大并容納更多的水分子,進而增加保水性[17],同時海藻糖具有穩(wěn)定和干燥蛋白質的功能,也可以有效地保護蛋白質的分子結構,在冷藏或冷凍的過程中防止蛋白冷凍變性[7]。

圖1 不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉經反復凍融后的持水率Fig.1 Water holding capacity of sturgeon treatedby different trehalose and composite phosphatesolution after multiple freezing-thawing注:不同小寫字母表示差異顯著P<0.05;圖2～圖3,表1同。

表1 不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉經反復凍融后的Ca2+-ATPase活性值Table 1 Ca2+-ATPase value of sturgeon treated by different trehaloseand composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

2.2 海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚反復凍融后蒸煮損失率的影響

由圖2可以看出,所有組別鱘魚肉的蒸煮損失率整體上隨著反復凍融次數的增加而增加。經海藻糖和磷酸鹽溶液處理過的鱘魚其蒸煮損失率顯著(P<0.05)小于對照組;且在第1、2次凍融時,第2次的蒸煮損失率相對于第1次差異不顯著(P>0.05),對于5.0%海藻糖+2.0%復合磷酸鹽和2.5%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽組,其蒸煮損失率在凍融第0、1、2次呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。所有組別的鱘魚肉在第4、5次凍融后的蒸煮損失率顯著提高(P<0.05)。經過5.0%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽處理過的鱘魚肉在整個凍融過程中的蒸煮損失率最低。有研究者認為蒸煮損失率在凍融處理過程中變化的可能原因是冰晶會消失并重新形成,肌纖維發(fā)生徑向收縮,肌纖維間出現(xiàn)較大的孔隙,從而使水進入肌肉的通道增加,水合性增加;反復凍融多次后,肌肉細胞結構被破壞,細胞間結合力因反復凍融而減小,在外力作用下肌肉中的水分流出,造成較大的蒸煮損失[18]。

圖2 不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉經反復凍融后的蒸煮損失率Fig.2 Cooking loss of sturgeon treated by different trehaloseand composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

2.3 海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚反復凍融后硫代巴比妥酸值的影響

如圖3,隨著凍融次數的增加,對照組鱘魚肉的TBARS值顯著增加(P<0.05),TBARS值越高,說明脂肪氧化次級產物越多,脂肪氧化程度越嚴重;其余經過不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉的TBARS值也是隨著凍融次數的增加而增大,但氧化程度均小于對照組別。其中經過5.0%海藻糖+2.0%復合磷酸鹽和2.5%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽處理的鱘魚肉在凍融1、3、5次后的TBA值相對穩(wěn)定,增長趨勢緩慢。魚肉TBARS值在反復凍融期間的升高與一些研究的結果相同,吳曉等[19]發(fā)現(xiàn)草魚和鯉魚魚糜的TBARS值在反復凍融四次之后顯著增加,Benjakul等[20]發(fā)現(xiàn)鯰魚的TBARS值在反復凍融過程中反復增加,并認為反復凍融過程中出現(xiàn)融化和重結晶現(xiàn)象,使得冰晶的大小和分布發(fā)生變化,會導致細胞膜結構的破壞,造成一些促進氧化組分的釋放,特別是血紅素鐵的釋放與脂肪氧化的程度有密切關系。另外,反復凍融過程中會使一些抑制脂肪氧化的抗氧化酶類發(fā)生變性,促進了脂肪氧化[21]。經過海藻糖和復合磷酸鹽處理的鱘魚肉其TBARS值小于未處理組別,可能是因為海藻糖可抑制發(fā)生脂肪酸敗的油脂成分中的脂肪酸的分解[7],且磷酸鹽能夠螯合肌肉中能激活氧化反應的金屬離子,對延緩不飽和脂肪酸氧化有作用[22]。

圖3 不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉經反復凍融后的TBARS值Fig.3 TBARS value of sturgeon treatedby different trehalose and composite phosphatesolution after multiple freezing-thawing

2.4 海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚反復凍融后Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性越高,表明蛋白質冷凍變性程度越低,品質也越好,從表1可看出,所有組別的鱘魚肉在經過反復凍融1、3、5次后,其Ca2+-ATPase活性都有所下降,表明肌纖維蛋白質都發(fā)生了不同程度的變性。對照組鱘魚肉在凍融1次時,其Ca2+-ATPase活性顯著低于(P<0.05)其他組別,為1.215 μmol Pi/mgprot/h,在凍融第5次后,其Ca2+-ATPase活性相比凍融第1次下降了31.2%。而經過復合抗凍劑處理的鱘魚肉其Ca2+-ATPase活性都高于對照組,特別是經過5.0%海藻糖+3%復合磷酸鹽處理過的鱘魚肉在凍融第1次時其Ca2+-ATPase活性為10.676 μmol Pi/mgprot/h,遠高于對照組,說明經過此濃度的海藻糖和復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉能有效防止肌原纖維蛋白質冷凍變性。有研究者[23]認為關于海藻糖的保護機制與糖類分子結構中的-OH基團數有關,基團數越多,對冷凍變性的防止效果也最好,通過改變蛋白質中存在水的狀態(tài)和性質間接對蛋白質作用,從而防止變性。而關于復合磷酸鹽的抗凍機理,普遍認為是復合磷酸鹽溶液呈弱堿性,使得魚肉產品pH維持中性,而肌原纖維蛋白質變性在中性時最小,但也有研究者[24]指出可能是蛋白質分子中的某些基團與磷酸鹽中的羥基反應,減少了蛋白質分子之間因官能團反應而產生的聚集變性。

2.5 海藻糖和復合磷酸鹽對鱘魚反復凍融后組織結構的影響

圖4為經過不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉在反復凍融后的掃描電鏡圖。從圖4中可以看出,對照組鱘魚肉在凍融1、3、5次之后,肌肉組織發(fā)生明顯的變化,肌原纖維出現(xiàn)明顯的收縮、排列紊亂和扭曲;肌原纖維之間孔隙變大;部分肌原纖維發(fā)生斷裂的現(xiàn)象,表明質地發(fā)生了嚴重的劣變。相比之下,經過不同濃度的海藻糖和復合磷酸鹽溶液浸泡后的鱘魚肉在凍融后的肌肉組織變化程度要小于對照組,肌原纖維中除間隙增大,略微扭曲外,基本形狀沒有被破壞。特別是經過5.0%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽溶液處理后的鱘魚肌肉,其組織在凍融5次后基本可以保持原有形狀,肌原纖維排列整齊規(guī)則,形態(tài)完整,保持了較好的質地。鱘魚肉肌肉組織的變化與肌原纖維的變性程度有關,經過5.0%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽溶液處理后的鱘魚肉在反復凍融處理后的Ca2+-ATPase活性最高,肌原纖維變性程度最低,有利于保持完好的形態(tài)。

圖4 不同濃度的海藻糖與復合磷酸鹽溶液處理的鱘魚肉經反復凍融后的掃描電鏡圖Fig.4 SEM image of sturgeon treated by different trehalose and composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

3 結論

不同濃度的海藻糖和復合磷酸鹽溶液可以延緩鱘魚肉在反復凍融期間持水性的下降、蒸煮損失率的上升、硫代巴比妥酸值的升高和Ca2+-ATPase活性的降低。經過5.0%海藻糖+3.0%復合磷酸鹽溶液處理后的鱘魚肉,其脂肪氧化程度較低,蛋白質變性程度最低,肌原纖維保持排列整齊規(guī)則,肌肉組織可保持原有的質地,凍融穩(wěn)定性最好,可用于鱘魚肉冷凍調理食品的加工和開發(fā)利用。海藻糖和復合磷酸鹽對魚肉感官和風味的影響有待進一步研究,以提高并優(yōu)化鱘魚肉產品的品質。