銀杏葉總黃酮超聲輔助提取條件優(yōu)化及其清除羥自由基能力

閆旭宇1,2,李 玲

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心,陜西延安 716000; 2.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南永州 425199)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物,在我國絕大部分地區(qū)均有分布。我國為世界銀杏的主產(chǎn)地[1]。銀杏葉的活性成分包括黃酮、萜內(nèi)酯、銀杏酸等主要成分,以及蛋白、多糖、維生素等其他物質(zhì)[1-2]。其中,黃酮和萜內(nèi)酯是發(fā)揮藥效的主要成分,具有抗氧化、抑制血小板活化因子、擴(kuò)張血管、調(diào)血脂等藥理作用,在臨床上用來治療血栓、炎癥和心血管疾病[3-4]。我國擁有世界70%以上的銀杏資源,可見,開發(fā)與利用銀杏葉資源意義重大。

目前,從銀杏葉中已鑒別出40多種黃酮類化合物。由于黃酮類化合物大多都含有游離羥基,易溶解于極性較大的有機(jī)溶劑[5],有機(jī)溶劑提取法是常用提取方法之一。尤其是有機(jī)溶劑乙醇無毒且易回收,乙醇浸提法是當(dāng)前國內(nèi)外采用最廣泛的提取銀杏葉總黃酮的方法,得率在2%左右[5]。雖然乙醇浸提法操作簡單,但其存在得率偏低、耗時(shí)費(fèi)材料等缺陷,研究發(fā)現(xiàn)采用微波、超聲波、加酶等輔助手段可以明顯提高得率[6-8]。利用超聲波破壞植物的細(xì)胞壁,提高溶劑進(jìn)入細(xì)胞的速度,縮短提取時(shí)間,提高活性成分溶解率和得率[5,9]。同時(shí),黃酮類化合物含有的游離羥基結(jié)構(gòu)決定了其較強(qiáng)的捕獲活性氧等自由基的能力,可作為一種天然安全有效抗氧化劑,減輕過量自由基對機(jī)體的損害,進(jìn)而降低心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生[10-11]。因此,在考慮成本情況下,采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,有助于提高黃酮得率。

本研究以銀杏葉為材料,以總黃酮得率為指標(biāo),利用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化銀杏葉總黃酮的提取工藝條件,并初步研究總黃酮對羥自由基的清除作用,以期為進(jìn)一步開發(fā)利用銀杏葉資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 采自延安大學(xué)校園內(nèi),選取新鮮、健康、無病蟲害的葉片;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸 所用試劑均為國產(chǎn)分析純,陜西和平化玻有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%) 上海一基生物試劑有限公司。

FW-100D型植物粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司;WG-71型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;AUX220型分析天平 日本島津公司;KQ500B型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司;RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏葉總黃酮的提取工藝流程 銀杏葉→清洗→60 ℃烘干至恒重→粉碎→過篩(80目)→超聲輔助乙醇回流提取(300 W)→提取兩次合并粗提液→室溫減壓抽濾→濾液減壓旋蒸→定容→提取液

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,在已配制好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH溶液,發(fā)生顯色反應(yīng)[12]。以不加蘆丁對照品溶液為參比,在510 nm處測吸光度,以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程y=12.816x+0.0053,R2=0.9981。

1.2.3 銀杏葉黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定總黃酮[12]。根據(jù)回歸方程計(jì)算出提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度,然后計(jì)算銀杏葉中總黃酮的得率(%):

式(1)

式中:Y為總黃酮得率(%),C為提取液中總黃酮濃度(mg/mL),V為定容體積(mL),N為稀釋倍數(shù),M為稱量的銀杏葉粉末質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇 準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別按料液比1∶25 (g/mL)加入濃度為70%、75%、80%、85%、90%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流50 min,研究乙醇濃度對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流50 min,研究料液比對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度的選擇 準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶25 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,分別在65、70、75、80、85 ℃的條件下超聲回流50 min,研究提取溫度對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥的銀杏葉粉末5份,分別加入料液比為1∶25 (g/mL)的濃度為75%的乙醇,在70 ℃的條件下超聲回流30、40、50、60、70 min,研究提取時(shí)間對銀杏葉總黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以總黃酮得率為響應(yīng)值,對影響總黃酮得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),確定超聲波輔助提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件。各因素的水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table ofresponse surface methodology

1.2.6 銀杏葉總黃酮清除羥自由基試驗(yàn) 銀杏葉總黃酮及VC對羥基自由基的清除率,采用水楊酸法[11]進(jìn)行測定。其中,總黃酮濃度(mg/mL)是以總黃酮含量計(jì)算的。羥基自由基的清除率計(jì)算公式如下:

式(2)

式中,E為羥基自由基清除率(%),A0為空白對照液的吸光值,Am為加入黃酮后的吸光值,An為不加H2O2時(shí)黃酮的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert V 8.0.6.1的Box-Behnken Design進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析,以及采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的確定 如圖1可知,隨著乙醇濃度的提高,銀杏葉總黃酮得率逐漸增加,當(dāng)乙醇濃度超過75%后,總黃酮得率緩慢增加,在80%時(shí)達(dá)到最高,之后總黃酮得率緩慢降低。由此表明,乙醇濃度高于適宜提取濃度不僅會增加其它脂溶性物質(zhì)的溶出量,降低總黃酮的相對溶出量,而且提高了投料成本[13]。考慮到提取效果及成本,最終確定乙醇的適宜濃度為80%。

圖1 不同乙醇濃度下總黃酮的得率Fig.1 The yield of total flavonoidsunder different ethanol concentrations

2.1.2 料液比的確定 由圖2可知,隨著提取液體積的增加,銀杏葉總黃酮得率先升后降。在料液比為1∶25 g/mL時(shí),總黃酮得率達(dá)到最大值;料液比為1∶35 g/mL時(shí)的得率略低于1∶20 g/mL時(shí)的得率,但高于1∶15 g/mL時(shí)的得率。由此表明,料液比為1∶25 g/mL時(shí)銀杏葉總黃酮已經(jīng)充分提取出來;繼續(xù)增加提取液提高了其他物質(zhì)的溶出,降低了總黃酮的相對比率。因此,料液比的適宜取值為1∶25 g/mL。

圖2 不同料液比條件下總黃酮的得率Fig.2 The yield of total flavonoidsunder different material-to-liquid ratios

2.1.3 提取溫度的確定 如圖3可知,隨著提取溫度由65 ℃上升到80 ℃,銀杏葉總黃酮得率直線上升,在80 ℃時(shí)得率最大,85 ℃時(shí)得率明顯下降。這表明溫度較低時(shí),總黃酮溶出較慢,但高于80 ℃的溫度時(shí),不僅提取溶劑乙醇易揮發(fā),而且會破壞部分黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其降解,加之雜質(zhì)溶出也會增多,導(dǎo)致總黃酮的提取效果降低[14]。故最終提取的適宜溫度為80 ℃。需要指出的是提取溫度水平的設(shè)定,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳溫度是80 ℃,但是當(dāng)溫度為70和85 ℃時(shí),得率相近,考慮到提取效果及成本,特選取70、75、80 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)溫度的三個(gè)水平。

圖3 不同提取溫度下總黃酮的得率Fig.3 The yield of total flavonoidsunder different extraction temperatures

2.1.4 提取時(shí)間的確定 如圖4可知,隨著超聲回流提取時(shí)間的延長,銀杏葉總黃酮得率先升后降,在50 min時(shí)達(dá)到最大值,之后繼續(xù)延長超聲時(shí)間,總黃酮得率明顯下降。這可能是由于超聲回流提取超過一定時(shí)間,提取溶劑損失量增加,黃酮穩(wěn)定性變差,同時(shí)引起其他物質(zhì)溶出,使總黃酮含量相對下降[11,14]。故控制提取時(shí)間在50 min左右時(shí),提取效果較好。

圖4 不同超聲時(shí)間下總黃酮的得率Fig.4 The yield of total flavonoidsunder different ultrasonic time

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以總黃酮得率為響應(yīng)值,對影響得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。各因素水平優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 銀杏葉總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and experiment results of response surfacemethodology of total flavonoids extraction rate from Ginkgo biloba leaves

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 基于響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表2),采用Design Expert 8. 0. 6軟件進(jìn)行多元擬合回歸分析,得到以銀杏葉總黃酮得率為響應(yīng)值的四元二次回歸模型方程:

Y=3.46+0.1A+0.087B+0.062C+0.057D+0.085AB+0.032AC+0.038AD+0.02BC+0.032BD-0.02CD-0.093A2-0.049B2-0.077C2-0.08D2。

由方程一次項(xiàng)可知,影響銀杏葉總黃酮得率的因素順序?yàn)?乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時(shí)間。由回歸模型方差分析結(jié)果(表3)可知,模型的P<0.0001,極顯著,該模型有意義;失擬項(xiàng)P>0.05,不顯著,說明模型與試驗(yàn)的差異值較小,由決定系數(shù)R2可知響應(yīng)值的變化有93.97%來源于四個(gè)試驗(yàn)因素,回歸模型擬合度良好,預(yù)測值與實(shí)測值之間相關(guān)性較好,試驗(yàn)誤差較小,可很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[15]。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

回歸模型方差分析中一次項(xiàng)的PA、PB、PC、PD、PAB、PA2、PC2、PD2值均小于0.01,PB2小于0.05,說明四個(gè)因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)、乙醇濃度和料液比的交互項(xiàng)均存在顯著性,而因素間的交互項(xiàng)及失擬項(xiàng)顯著性相對較差。表明四個(gè)因素對響應(yīng)值總黃酮得率均存在顯著影響,其關(guān)系是一種非線性關(guān)系[15-16]。

由方差分析可知,乙醇濃度和料液比的交互作用對銀杏葉總黃酮得率影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。為更直觀形象地說明其交互影響作用,利用Design Expert 8. 0. 6軟件對交互項(xiàng)作響應(yīng)曲面圖和等高線圖(圖5)。可以看出,乙醇濃度和料液比相互作用的響應(yīng)面曲面坡度較陡峭,等高線圖基本呈扁平橢圓狀,表明乙醇濃度和料液比交互作用較強(qiáng),對銀杏葉總黃酮得率的影響顯著[15-17]。

圖5 乙醇濃度和料液比對銀杏葉總黃酮得率的交互影響Fig.5 Effect of interaction of ethanol concentrationand material-to-liquid ratio on total flavonoidsyield from Ginkgo biloba leaves

2.2.3 最佳提取條件的確定與驗(yàn)證 用Design Expert 8. 0. 6軟件進(jìn)一步分析回歸方程,得出銀杏葉總黃酮提取的最適條件為:乙醇濃度80.66%、料液比1∶25.58 g/mL、提取溫度75.47 ℃、提取時(shí)間50.57 min,預(yù)測得率為3.606%。考慮到實(shí)際操作的局限性,提取工藝最終修正為:乙醇濃度81%、料液比1∶26 g/mL、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間51 min。此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,重復(fù)試驗(yàn)3次,銀杏葉總黃酮實(shí)際得率為3.58%,與預(yù)測值(3.606%)接近,其相對誤差為0.72%。本實(shí)驗(yàn)超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮的得率高于乙醇浸提法的得率2.20%[18],以及高于利用該法的張光輝等的得率2.82%[7],并且略高于霍銀強(qiáng)等的得率3.51%[19],這可能是由于本實(shí)驗(yàn)中乙醇濃度81%高于張光輝等的75%,以及超聲功率300 W高于霍銀強(qiáng)等的100 W,相對較高的乙醇濃度和超聲功率會導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)總黃酮的最大溶出,以及與選取材料不同及總黃酮得率計(jì)算方法不同有關(guān)[20]。

2.3 銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除作用

銀杏葉總黃酮對羥自由基(·OH)的清除結(jié)果見圖6。銀杏葉總黃酮和VC對羥自由基的清除率均隨濃度的增加而逐漸增加,清除羥自由基能力與濃度存在一定的量效關(guān)系[11]。在相同濃度下,銀杏葉總黃酮對·OH的清除率高于VC,說明銀杏葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖6 銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability oftotal flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化分析得到銀杏葉總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度81%、料液比1∶26 g/mL、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間51 min,銀杏葉總黃酮得率為3.58%。由方差分析和因素間交互作用分析得出,四個(gè)因素對銀杏葉總黃酮提取均有顯著影響(P<0.05),順序?yàn)?乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時(shí)間,且乙醇濃度和料液比對銀杏葉總黃酮得率的交互影響較強(qiáng)。本研究采用的超聲輔助乙醇法可靠,適宜于在省時(shí)間、低耗能的條件下提取銀杏葉總黃酮,并在提取時(shí)要優(yōu)先考慮乙醇濃度和料液比對總黃酮得率的交互影響。在相同質(zhì)量濃度下,本實(shí)驗(yàn)提取的銀杏葉總黃酮對羥自由基的清除效果高于VC,具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可以作為一種羥基自由基的天然清除劑進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。