響應(yīng)面法優(yōu)化棘托竹蓀孢子多糖提取工藝及抗氧化活性研究

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(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,福建福州 350013; 2.邵武市沿山鎮(zhèn)農(nóng)技站,福建邵武 354002)

棘托竹蓀(Dictyophoraechinovolvata)為鬼筆科(Phallaceae)竹蓀屬(Dictyophora)名貴食用菌,主產(chǎn)區(qū)為福建、四川、湖南等地,其香味濃郁,滋味鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、寧神健體、益氣補(bǔ)腦、潤(rùn)肺止咳、補(bǔ)氣養(yǎng)陰及清熱利濕等功效[1]。竹蓀成熟子實(shí)體可分為菌體(菌柄和菌裙)、菌蓋(附著孢體)以及菌托(外皮和膠質(zhì))三大部分[2],其中棘托竹蓀孢子與菌體部分干重比約為1∶3,數(shù)據(jù)表明,以福建省年產(chǎn)竹蓀0.3～0.5萬(wàn)噸計(jì),每年就產(chǎn)有千余噸竹蓀孢子[3]。但在竹蓀采收過程只收集菌體部分,而菌蓋及其上的孢子被直接遺棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。食用菌加工過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物具有極大的開發(fā)價(jià)值[4],迄今為止鮮見竹蓀孢子開發(fā)利用的報(bào)道。僅有對(duì)短裙竹蓀產(chǎn)孢組織電鏡觀察[5]、棘托竹蓀孢子粉抗氧化活性[6]、孢子超臨界萃取[3]和孢子傳播[7]等報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖具有抗氧化[8-9]、抗腫瘤[10-12]、免疫調(diào)節(jié)[13-14]、抗疲勞[15]及保護(hù)肝功能[16-17]等功能。但對(duì)竹蓀多糖的提取和研究主要以其菌體為主[8-11],少有報(bào)道從竹蓀菌蓋[18]、菌托[19]和菌絲[20]中提取多糖,未見采用竹蓀孢子提取多糖及其活性的研究。王彥輝[21]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)破壁棘托竹蓀孢子粉中粗多糖含量為8.61%,可見竹蓀孢子可做為獲取竹蓀多糖的原料來(lái)源。

真菌多糖的分子量、糖苷鍵鍵型、空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)改性等對(duì)其生物活性有顯著的影響[22]。大部分竹蓀多糖提取僅以多糖得率為指標(biāo),未能兼顧提取條件對(duì)多糖活性的影響[23-24]。本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比、pH對(duì)多糖得率及多糖活性的影響,進(jìn)而采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法,確定竹蓀孢子活性多糖提取的最優(yōu)參數(shù),以期最大限度地從竹蓀孢子中提取多糖,且不破壞多糖的抗氧化性,為分離、純化及鑒定竹蓀孢子活性多糖提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘托竹蓀菌球 由邵武市南山食用菌種植農(nóng)民專業(yè)合作社提供;無(wú)水乙醇、苯酚、氯仿、正丁醇、硫酸、醋酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、水楊酸(均為分析純) 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司。

UV-2800AH型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DL SPW-10TJ型-5型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;R209型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;3-18K型低溫超速離心機(jī) Sigma公司;ALPHA1-4LD PLUS冷凍干燥機(jī) Christ公司;WB-20恒溫水浴鍋 瑞士Salvis LAB;WZJ6型系列貝利微粉機(jī) 山東神爵機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹蓀孢子的收集及破壁竹蓀孢子的制備 新鮮的棘托竹蓀菌球待其開傘后將菌蓋剝離,純水洗滌菌蓋上的孢子,孢子液100目過濾,濾液4000 r/min離心20 min,將獲得的沉淀冷凍干燥,使用貝利超微粉碎機(jī),功率1.1 kW,電壓380 V,粉碎時(shí)間20 min,獲得破壁竹蓀孢子(破壁率90%以上)。

1.2.2 竹蓀孢子多糖的提取工藝 取破壁竹蓀孢子按比例加去離子水,氫氧化鈉和醋酸調(diào)節(jié)pH,熱水浸提后4000 r/min離心20 min,取上清液60 ℃減壓濃縮后加入4倍體積95%乙醇,靜置過夜沉淀,采用低溫超速離心機(jī)10000 r/min離心獲取沉淀,加入去離子水溶解,Sevage法除蛋白,再次醇沉、低溫冷凍干燥獲得粗多糖。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 考察提取溫度、提取pH、料液比和提取時(shí)間對(duì)多糖得率和多糖活性的影響。基礎(chǔ)條件[6,23-24]為料液比1∶20、pH7、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間90 min的條件下,設(shè)計(jì)各因素水平為:料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30;pH3、5、7、9、11;提取溫度50、60、70、80、90 ℃;提取時(shí)間30、60、90、120、150 min。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇提取溫度、提取時(shí)間、液料比和pH比4個(gè)因素為自變量,以竹蓀孢子多糖提取率為響應(yīng)值,依據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化竹蓀菌托多糖提取工藝,以-1、0、1編碼自變量低、中、高水平,因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 竹蓀孢子多糖得率的測(cè)定 按照苯酚-硫酸法測(cè)定孢子多糖,計(jì)算孢子多糖得率。分別取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL,加水至1.0 mL后,加入1 mL苯酚溶液、5 mL濃硫酸,充分混合,置于30 ℃水浴反應(yīng)20 min后,于490 nm下測(cè)定吸光度,并以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)多糖溶液稀釋20倍,取1.00 mL于具塞比色杯中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=8.8443x+0.0586,R2=0.9985,計(jì)算孢子多糖質(zhì)量。

多糖得率(%)=(多糖質(zhì)量/所用孢子粉質(zhì)量)×100

1.2.6 竹蓀孢子多糖清除羥基自由基(·OH)活性測(cè)定 研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?多糖對(duì)羥基自由基清除效果較好[15,25]。因此本實(shí)驗(yàn)參考Smironff等[26]的方法,以清除羥基自由基(·OH)的IC50檢測(cè)多糖活性。在25 mL的比色管中依次移取2 mL 6 mmol/L的FeSO4和2 mL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,混合均勻后加入2 mL不同濃度(2、4、6、8、10 mg/mL)的樣品搖勻,再加入2 mL 6 mmol/L H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng),在36～37 ℃的恒溫水浴 30 min后在分光光度計(jì)上(510 nm)測(cè)其吸光度值(Ax);取2 mL H2O代替2 mL 6 mmol/L H2O2,測(cè)其吸光度值(As);取2 mL H2O代替不同濃度的樣品,測(cè)其吸光度值(Ao)。每個(gè)樣品每個(gè)濃度重復(fù)3次,取平均值。清除率R(%)按下式計(jì)算:

式中:Ax為加樣品的吸光度;As為樣品本底的吸光度;Ao為不加樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和計(jì)算孢子多糖清除羥基自由基的IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)竹蓀孢子多糖得率及抗氧化性的影響 由圖1可見,隨著提取溫度的升高,多糖得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。提取溫度由50 ℃升高至60 ℃時(shí),多糖得率顯著升高(P<0.05),提取溫度為60～90 ℃時(shí),多糖得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),但無(wú)顯著性變化(P>0.05),在提取溫度為80 ℃時(shí),多糖得率最大,為9.19%。推測(cè)溫度較高時(shí)多糖結(jié)構(gòu)受破壞導(dǎo)致得率下降。多糖抗氧化活性隨提取溫度的升高而下降,50 ℃提取的多糖與高于80 ℃提取的多糖相比活性更高,達(dá)差異顯著水平(P<0.05),60～90 ℃提取的多糖抗氧化活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由于提取溫度較高,導(dǎo)致提取獲得無(wú)抗氧化活性的多糖成分較多,即同等單位濃度下,高溫提取的多糖活性較低溫提取的活性更低。綜合考慮,選擇60、70、80 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 提取溫度對(duì)竹蓀孢子多糖得率及活性的影響Fig.1 Effect of extraction temperature of polysaccharidesfrom the spores of Dictyophora echinovolvata注:數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,小寫字母代表差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

圖4 pH對(duì)竹蓀孢子多糖得率及活性的影響Fig.4 Effect of pH value of polysaccharidesfrom the spores of Dictyophora echinovolvata

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率及多糖活性的影響 由圖2可見,多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,但提取時(shí)間為150 min時(shí)的多糖得率與120 min時(shí)相比無(wú)顯著性變化(P>0.05),原因可能是提取一定時(shí)間后,細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透濃度逐漸相等,多糖含量不再明顯增加;對(duì)不同提取時(shí)間多糖活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在150 min內(nèi),提取時(shí)間對(duì)多糖活性影響不顯著(P>0.05)。綜合考慮選擇60、90、120 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)竹蓀孢子多糖得率及活性的影響Fig.2 Effect of extraction time of polysaccharidesfrom the spores of Dictyophora echinovolvata

2.1.3 料液比對(duì)多糖得率及多糖活性的影響 由圖3可見,料液比1∶10～1∶25間,多糖得率隨加水量的增加而增加,按料液比1∶25提取時(shí)與料液比1∶10多糖率相比差異達(dá)顯著性水平(P<0.05),但料液比在1∶20后,多糖提取率增長(zhǎng)趨于緩慢。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是對(duì)于一定量的破壁竹蓀孢子粉,溶劑用量的增加可以增加固液接觸面積和質(zhì)量濃度差,有利于擴(kuò)散速度的提高。當(dāng)提取液用量繼續(xù)增大,固液質(zhì)量濃度差的增幅逐漸降低,多糖提取率的增加也趨于平緩。多糖活性隨加水量的增加而略有下降,按料液比1∶25、1∶30提取時(shí)與料液比1∶15多糖活性相比活性更低,差異達(dá)顯著水平(P<0.05),推測(cè)主要原因?yàn)槿軇┯昧枯^高時(shí),提取獲得的無(wú)活性多糖增加,導(dǎo)致單位濃度的多糖活性降低。綜合考慮選擇1∶15、1∶20、1∶25進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)竹蓀孢子多糖得率及活性的影響Fig.3 Effect of solid-to-water ratio ofpolysaccharides from the spores of Dictyophora echinovolvata

2.1.4 pH對(duì)多糖得率及多糖活性的影響 結(jié)果如圖4所示,多糖得率隨pH的增加而增加,pH11條件下多糖得率與酸性條件下相比顯著升高(P<0.05),但在pH9以下提取多糖得率無(wú)顯著性變化(P>0.05),糖有酸性、中性及堿性之分,提取液的pH直接影響到帶電狀態(tài),進(jìn)而影響溶解度,因此在不同pH條件下,乙醇沉淀多糖得率也有所不同。竹蓀孢子多糖在偏堿條件下得率更高,推測(cè)在堿性條件下多糖溶解度更高所致。對(duì)多糖活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下提取的多糖與pH5～9間的提取的多糖活性相比顯著降低(P>0.05),強(qiáng)酸條件下活性多糖結(jié)構(gòu)易被破壞而失活,而強(qiáng)堿條件下則可能提取得到更多無(wú)活性多糖。因此雖然在pH11條件下提取多糖得率最高,綜合考慮選擇pH5、7、9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果 Table 2 The design and results of response surface experiment

采用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.0對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到的分析結(jié)果見表3。經(jīng)回歸擬合后,各影響因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用以下的方程表示:多糖得率(%)=8.08+0.17A+0.94B+1.39C-0.46D+0.11AB-0.44AC-0.14AD+0.15BC-0.86BD+0.49CD-0.10A2-0.28B2+0.24C2-0.70D2。回歸模型P<0.0001,表明回歸模型達(dá)極顯著水平;失擬項(xiàng)P=0.0594,不顯著,說明該模型成立。回歸模型中一次項(xiàng)B(提取時(shí)間)和C(pH)、D(料液比)、二次項(xiàng)D2和交互項(xiàng)BD的影響極顯著(P<0.01)。復(fù)決定系數(shù)R2=0.9327,說明響應(yīng)值的變化有93.27%來(lái)源于所選變量,得到模型擬合程度好,實(shí)驗(yàn)誤差小。綜上分析,該模型能較好地分析和預(yù)測(cè)竹蓀孢子提取工藝。

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis of variance table of regression equation

2.3 因素間的交互作用

提取溫度與提取時(shí)間的交互作用如圖5所示,當(dāng)提取溫度不變時(shí),隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)多糖得率呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì);當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí),多糖得率隨提取溫度升高增加不明顯,而長(zhǎng)時(shí)間提取條件下,多糖得率隨溫度升高而增加。因此,延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于竹蓀多糖的提取。提取溫度與pH間的交互作用如圖6所示,當(dāng)提取溫度不變時(shí),多糖得率隨著pH增加而增加;在較強(qiáng)堿性條件下,多糖得率隨溫度升高而下降。可見較低溫度及偏堿性條件有利于多糖提取。 提取溫度與料液比間的交互作用如圖7所示,當(dāng)提取溫度不變時(shí),料液比對(duì)多糖得率的影響明顯,隨著溶劑的增加有先增后平緩的趨勢(shì);在不同料液比條件下,提取溫度對(duì)多糖得率影響均不大。提取時(shí)間與pH的交互作用如圖8所示,相同提取時(shí)間條件下,多糖得率均是隨pH增加而增加;延長(zhǎng)提取時(shí)間均可提高多糖得率,在偏堿條件下對(duì)多糖得率提高的影響更明顯。pH與料液比的交互作用如圖9所示,相同料液比條件下,多糖得率均隨pH增加而增加,溶劑較少的條件下增加明顯。同一pH條件下,料液比對(duì)多糖得率有先增后降的趨勢(shì)。

圖5 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of extraction temperatureand extraction time and their interactions on polysaccharide content

圖6 提取溫度與pH對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of extraction temperature and pH and their interactions on polysaccharide content

圖7 提取溫度與料液比對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of extraction temperatureand solid-to-water ratio and their interactions on polysaccharide content

圖8 提取時(shí)間與pH對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot of extraction time and pH and their interactions on polysaccharide content

圖9 pH與料液比對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface plot and contour plot of pH and solid-to-water ratio and their interactions on polysaccharide content

圖10 提取時(shí)間與料液比對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface plot and contour plot of extraction timeand solid-to-water ratio and their interactions on polysaccharide content

響應(yīng)面分析的等高線圖可直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響及最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用,圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形與之相反。提取時(shí)間和料液比的交互作用極顯著,且提取時(shí)間軸向等高線變化密集,料液比軸向等高線變化相對(duì)稀疏,在長(zhǎng)時(shí)間提取條件下,料液比對(duì)多糖得率的影響明顯,隨著溶劑的增加而增加;但在較短提取時(shí)間條件下,隨溶劑的增加多糖得率有先增后降的趨勢(shì)。

2.4 竹蓀孢子多糖提取工藝條件的確定

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析,得到竹蓀孢子多糖提取的最適工藝條件為:提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間120 min、pH=9.0、料液比為1∶20,多糖得率達(dá)到10.53%。采用上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行多糖提取的實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步檢驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)方法的可靠性。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,測(cè)得實(shí)際多糖得率為9.87%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值誤差在1%以內(nèi)。因此,采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝條件具有實(shí)際意義與實(shí)用價(jià)值。

2.5 優(yōu)化后竹蓀孢子多糖的清除羥基自由基活性

取優(yōu)化條件后提取獲得竹蓀孢子多糖,檢測(cè)其清除羥基自由基活性,結(jié)果如圖11所示。在2～10 mg/mL范圍內(nèi),孢子多糖對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度增加而增加,采用SPSS軟件計(jì)算獲得IC50為4.67 mg/mL。

圖11 竹蓀孢子多糖對(duì)·OH的清除率Fig.11 ·OH radical-scavenging activity of polysaccharidesfrom the spores of Dictyophora echinovolvata

3 討論與結(jié)論

關(guān)于竹蓀多糖提取工藝已有較多報(bào)道,主要圍繞提取溫度、提取時(shí)間和料液比等因素進(jìn)行優(yōu)化。其中料液比及提取時(shí)間各研究結(jié)果差異不大,料液比為1∶15～1∶40之間[19,27],提取時(shí)間2～4 h[19,24],而提取溫度結(jié)果差異較大,60[27]、80[25]、8518]、95 ℃[28]均有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),提取溫度50～80 ℃間,多糖得率隨溫度升高而增加,90 ℃時(shí)略有下降。但溫度較高時(shí),多糖活性明顯降低。可見高溫雖然可提高多糖得率,但對(duì)多糖活性有一定的負(fù)面影響,以提取活性多糖為目標(biāo)時(shí),應(yīng)盡可能選擇較低溫度。料液比和提取時(shí)間均對(duì)多糖得率有正向影響,隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)和溶劑增加,多糖得率都有提高,但提取時(shí)間高于120 min后多糖得率增加不明顯,料液比1∶20后增加溶劑對(duì)得率增高影響不大,且降低了多糖活性,推測(cè)是由于雜多糖含量的增加。在多糖提取過程中,在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂;而堿性條件有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的得率,但提取液中含有其它雜質(zhì)或無(wú)活性多糖。本文發(fā)現(xiàn)偏堿條件有利于多糖提取,但強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下獲得多糖活性較低。

綜上所述,竹蓀孢子多糖具有抗氧化活性,提取工藝條件的變化不僅影響多糖得率,也影響多糖活性。竹蓀孢子多糖的最優(yōu)提取工藝條件為:提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間120 min、pH=9.0、料液比為1∶20,測(cè)得實(shí)際多糖得率為9.87%,并測(cè)得竹蓀孢子多糖清除羥基自由的IC50為4.67 mg/mL,為下一步分離、純化及鑒定竹蓀孢子活性多糖提供基礎(chǔ)。