荷葉離褶傘多糖提取工藝優化及抗氧化活性研究

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(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014; 2.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

食用菌味道鮮美,不僅是一種受歡迎的蔬菜,也是一種功能性食品,我國有食用菌350多種,具有廣闊的消費市場。食用菌中含有多種氨基酸、微量元素以及多糖,早在明朝時期它們的營養以及藥用價值就受到了人們的關注[1]。食用菌的一些代謝產物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏的作用[2]。自1968年第一次報道食用菌子實體水提物中具有抗腫瘤的活性物質后,科學家們開始對食用菌中的抗腫瘤物質產生了興趣,后來研究發現該水提取物中大部分物質為食用菌多糖[3]。食用菌多糖廣泛存在于食用菌細胞膜中,是食用菌中最豐富的生物聚合物,也是最主要的活性物質,具有多種生物學功能[4-5]。眾多報道表明食用菌多糖能有效預防腫瘤的發生,在降低血糖、血脂、抗血栓等方面同樣起著重要作用,且不產生毒副作用,被稱為“生物反應調節劑”[6-7]。食品及醫學界研究人員發現,自由基以及氧化劑會分解細胞,干擾人體正常的代謝途徑而威脅到人體健康,食用菌多糖具有較好的抗氧化活性,可以通過抗氧化作用減緩運動性疲勞,有助于機體的快速恢復[8]。目前天然抗氧化劑的開發以及應用受到了極大的關注,也是國內外研究的熱點[9],作為一種天然抗氧化劑,食用菌多糖在健康安全性方面遠高于人工合成抗氧化劑。

荷葉離褶傘又稱鹿茸菇、泥窩、荷葉蘑,屬于傘菌目、口蘑科、離褶傘屬,是一種非常珍貴的藥食兩用的食用真菌,主要分布在我國中南部等地,研究者在荷葉離褶傘中分離得到11種多糖[10]。目前對荷葉離褶傘的研究大都集中在人工培育方面,對于其生物活性物質的研究并不多見[11],僅甘肅河西學院團隊對荷葉離褶傘多糖發酵以及抗腫瘤方面進行了相關研究。本文采用水提醇沉法來提取荷葉離褶傘多糖,并且優化該提取工藝,為制定科學、經濟的荷葉離褶傘多糖制備工藝提供實驗依據。同時對提取出來的多糖進行抗氧化活性研究,為將來研發有關荷葉離褶傘的保健以及藥用產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉離褶傘 江蘇江南生物科技公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛化成工業發展有限公司;2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;過硫酸鉀(K2S2O8) 國藥集團化學試劑有限公司;乙醇(分析純)、十二水合磷酸氫鈉、二水合磷酸二氫鈉、抗壞血酸(VC)、葡萄糖、濃硫酸、苯酚 南京化學試劑股份有限公司。

TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;HH系列數顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司;DNM-9602G酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷葉離褶傘預處理 將荷葉離褶傘切成段后于55 ℃烘箱中干燥至恒重,用粉碎機粉碎成粉末過60目篩,按1∶20料液比加入85%乙醇(w/v),在70 ℃條件下封口水浴8 h,重復處理至溶液無顏色,將浸泡過的樣品粉末于50 ℃烘箱中烘干至恒重備用[12]。

1.2.2 多糖提取 取上述乙醇浸泡過后的荷葉離褶傘干粉,按一定的溫度、時間、液料比、提取次數進行熱水浸提,浸提結束后6500 r/min離心10 min,收集并合并上清液。將上清液按體積比1∶3加入80%乙醇進行醇沉,封口后4 ℃放置過夜,6500 r/min離心10 min得沉淀物。加入一定體積超純水使多糖復溶,進一步去除其他雜質,上清液冷凍干燥得到荷葉離褶傘粗多糖。采用苯酚-硫酸法[13]對荷葉離褶傘多糖含量進行測定,根據所測得的標準曲線方程計算多糖得率。

粗多糖得率計算公式如下:

式中,Y為荷葉離褶傘多糖得率,%;c為多糖濃度,g/mL;V為多糖溶液體積,mL;D為稀釋倍數;m為荷葉離褶傘多糖干粉質量,g。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對多糖得率的影響 將液料比固定為30∶1 (mL/g)分別提取2次、每次提取時間為3 h,研究不同溫度(80、85、90、95、100 ℃)對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對多糖得率的影響 將在液料比固定為30∶1 (mL/g)、分別提取2次、每次提取溫度90 ℃,研究不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對多糖得率的影響。

1.2.3.3 提取液料比對多糖得率的影響 將提取溫度固定為90 ℃、分別提取2次、每次提取時間3 h,研究不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取次數對多糖得率的影響 將液料比固定為30∶1 (mL/g)、每次提取時間3 h、提取溫度90 ℃,研究不同提取次數(1、2、3、4次)對多糖得率的影響。

1.2.4 響應曲面法試驗設計 在單因素實驗基礎上,以多糖得率為響應值,初步確定幾個提取因素的范圍。再選取提取溫度(X1)、時間(X2)、液料比(X3)這三個對荷葉離褶傘多糖得率影響較大的因素進行Box-Behnken試驗設計,其因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 荷葉離褶傘抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除活性測定 DPPH自由基清除活性參照文獻[14],使用比色法進行測定,分別配制質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL多糖溶液,吸取50 μL不同質量濃度多糖溶液于96孔板中,再依次加入25 μL 0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,100 μL超純水,振蕩96孔板使得整個體系均勻,30 ℃在暗處反應30 min,于酶標儀571 nm處測定吸光值。VC作為陽性對照組。自由基清除率按照下面公式計算:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為對照試驗(水代替樣品)吸光值;A1為樣品試驗吸光值;A2為樣品干擾試驗(無水乙醇代替DPPH溶液)吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除活性測定 ABTS自由基清除率參照文獻[15]方法進行修改測定。將7 mmol/L ABTS溶液與4.95 mmol/L K2S2O8溶液按1∶1 (v/v)混合配制成ABTS+工作液,放置在室溫暗處12 h后使用。ABTS+工作液用PBS(0.2 mol/L,pH7.4)稀釋至734 nm下的吸光值在0.70±0.02左右。分別配制質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL多糖溶液,吸取200 μL ABTS+工作液于96孔板中,再加入20 μL不同濃度多糖溶液,混合均勻后于室溫放置6 min,于酶標儀測定734 nm處的吸光度。以VC作為陽性對照組。自由基清除率按照下面公式計算:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為對照試驗(水代替樣品)吸光值;A1為樣品試驗吸光值;A2樣品干擾試驗(PBS代替ABTS+工作液)吸光值。

1.3 數據處理

每組試驗均重復3次。用SPSS 22.0軟件對試驗結果進行單因素及組間差異統計分析,數據以MEAN±SD表示,根據Design-Expert 10進行響應面試驗設計,用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖1可知,在溫度80～90 ℃之間,隨著溫度升高荷葉離褶傘多糖得率顯著增加(P<0.05),溫度在90 ℃時多糖得率最大,為5.32%,溫度增加到95～100 ℃之間,多糖得率下降,與90 ℃相比有顯著差異(P<0.05)。分析原因可能是80～90 ℃之間隨著溫度升高,分子之間運動加快,碰撞的幾率增大,導致溶質溶出的速率增大以至于多糖得率增加[16]。95～100 ℃之間由于溫度過高,多糖糖苷鍵遭到破壞,導致得率下降[17]。多糖得率隨著溫度上升先增大后減小的結論與崔鳳杰等[18]灰樹花多糖提取溫度優化結果一致,同時溫度過高還會使多糖部分功能活性喪失。因此選取90 ℃作為響應面試驗的中心點。

圖1 提取溫度對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extractionyield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides注:字母不同表示組間差異顯著(P<0.05);圖2～圖4、圖6～圖7同。

2.1.2 提取時間對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖2可知,提取時間1～2 h內,多糖得率無顯著差異(P>0.05),可能是由于提取時間較短多糖沒有充分溶出[19]。與提取時間2 h相比,3 h多糖得率顯著升高(P<0.05),達到最大值為5.29%,之后隨著提取時間增加(3～4 h),多糖得率顯著下降(P<0.05),在4～5 h趨于平穩。由于在荷葉離褶傘多糖不斷溶出的同時,長時間的高溫環境容易導致多糖結構被破壞,因而長時間提取會使多糖得率顯著下降(P<0.05)[20]。在響應面優化試驗設計中,選擇提取時間為3 h作為中心點。

圖2 提取時間對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.1.3 提取液料比對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖3可知,當提取液料比在10∶1～30∶1 (mL/g)之間,隨著液料比增大多糖得率顯著增加(P<0.05),在液料比為30∶1 (mL/g)時多糖得率最大,為5.30%,之后增加液料比多糖得率無顯著差異(P>0.05)。增加溶劑量有助于多糖溶出,但是考慮到經濟成本以及試驗工作量,選取30∶1 (mL/g)液料比作為最后優化試驗的中心點。

圖3 提取液料比對荷葉離褶傘多糖得率的影響Fig.3 Effect of ratio of water to material on the extractionyield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.1.4 提取次數對荷葉離褶傘多糖得率的影響 由圖4可知,與提取次數為1次相比,提取2次后多糖得率顯著增加(P<0.05),隨后增加提取次數多糖得率有所上升但是差異不顯著(P>0.05),說明經過2次提取多糖已經充分溶于水中。因此將提取次數設定為2次作為后續響應面試驗的參數。

圖4 提取次數對荷葉離褶傘多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.2 響應面試驗

2.2.1 響因面試驗結果與分析 以提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)作為自變量,荷葉離褶傘多糖得率(Y)為因變量,試驗方案設計及響應值見表2,由結果分析得出響應變量和響應值之間的多元二次回歸方程如下:

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

Y=-213.79500+4.59050X1+6.76375X2+0.27113X3+4.468×10-15X1X2+5×10-4X1X3-0.02520X2X3-0.025850X1X1-0.96875X2X2-0.00378750X3X3

表3 多元回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic polynomial model

2.2.2 響應面圖與等高線圖結果分析 等高線圖呈現圓形代表兩因素的交互作用對多糖得率沒有顯著性影響,呈現橢圓形則代表有顯著影響,響應曲面坡度越陡峭,說明相應的兩因素的交互作用對多糖得率影響就越大[22]。從圖5的等高線圖可以看出,提取時間與液料比兩兩交互對多糖的得率有顯著影響。從響應曲面圖看出,圖5B、圖5C比圖5A的曲面要陡峭一點,說明X1提取溫度和X3提取液料比交互作用、X2提取時間和X3液料比交互作用對多糖得率影響較大,與表3的結果相對應。

圖5 提取溫度、提取時間、液料比交互作用對荷葉離褶傘多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of the mutual effects of extraction temperature,extraction time and ratio ofwater to material on the extraction yield of Lyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides注:A:提取溫度與提取時間,B:提取溫度與提取液料比,C:提取時間與提取液料比。

根據 Design-Expert 10對試驗結果分析得出對應的最佳工藝為:提取溫度89.10 ℃、提取時間3.08 h、液料比31.41∶1 (mL/g),預測的最高得率為5.38%。考慮到實際操作過程方面,最后將條件設定為:提取溫度89 ℃、提取3 h、液料比30∶1 (mL/g),在此提取條件下進行三次重復驗證,得出荷葉離褶傘的最后的率為5.35%±0.12%,該得率與預測得率相差不大,說明該模型可用。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 荷葉離褶傘多糖DPPH自由基清除能力測定 由圖6可知,在質量濃度范圍內,荷葉離褶傘多糖DPPH自由基清除率隨濃度增大而增加,呈劑量依賴關系[23],在質量濃度為1.0 mg/mL時,DPPH清除率達到最大值,為45.87%±2.12%。由結果可知,荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基的半抑制濃度IC50大于1.0 mg/mL,根據軟件計算其IC50為1.40 mg/mL,說明荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基有一定清除能力,冮潔等[24]等研究的羊肚菌菌絲體鋅多糖抗氧化性試驗中,也表明DPPH自由基清除能力與多糖質量濃度有關。因荷葉離褶傘多糖為酸性多糖且含有硫酸基,所以表現出較好的抗氧化能力。在Chen等[25]研究的苦瓜多糖結果也表明,苦瓜多糖中硫酸基可以提高抗氧化能力。圖中對照組VC濃度在1.0 mg/mL時,清除率達到最大為100%,在試驗的質量濃度范圍內,樣品組的DPPH自由基清除能力小于VC。

圖6 荷葉離褶傘多糖對DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging capacity ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

2.3.2 荷葉離褶傘多糖ABTS自由基清除能力測定 由圖7可知,在質量濃度為0～1.0 mg/mL范圍內,荷葉離褶傘多糖ABTS自由基清除率隨濃度增大而增加,同時量-效關系明顯,在質量濃度為1.0 mg/mL時,ABTS自由基清除率達到最大值為76.49%±1.56%。由結果可知,荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基的半抑制濃度IC50為0.44 mg/mL。與其他食用菌相比荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基清除能力遠高于真姬菇多糖[26]、香菇多糖[27]。VC對照組濃度在1.0 mg/mL時,清除率達到最大值,為100%。不同質量濃度多糖對ABTS自由基清除能力差異明顯,但均小于VC對照組,這與Solomon等[28]研究的黃羽扇豆多糖對ABTS自由基清除能力的結論一致。與圖6相比,多糖在相同質量濃度下對ABTS自由基清除率要大于DPPH。原因是ABTS自由基適合評價親水性抗氧化劑,而DPPH自由基適合評價親脂性抗氧化劑[29]。

圖7 荷葉離褶傘多糖對ABTS自由基清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging capacity ofLyophyllum decastes(Fr.)Singer polysaccharides

3 結論

在單因素實驗的基礎上,通過響應面試驗優化得到荷葉離褶傘提取溫度在89 ℃,提取時間為3 h,液料比為30∶1 (mL/g)時,多糖得率最大為5.35%±0.12%。抗氧化活性研究發現荷葉離褶傘多糖的抗氧化性隨多糖濃度增加而增大,對DPPH、ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為1.40、0.44 mg/mL。具有較好的抗氧化能力,為天然抗氧化劑的開發提供了新的路徑。荷葉離褶傘多糖作為一種應用前景廣泛的生物活性物質,可以應用于更多領域。