黃酒米漿水中抗菌乳酸菌的篩選及特性分析

(浙江樹人大學生物與環境工程學院,浙江杭州 310015)

黃酒(Huangjiu)是我國民族特產和傳統發酵食品之一,通常以糯米為原料,經浸米、蒸煮、加曲、糖化發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成[1-2]。浸米是黃酒生產的第一個工藝,以生產用水對糯米進行浸泡,每生產1噸黃酒約產生2噸米漿水[3]。米漿水富含淀粉、蛋白質、糖類、有機酸等營養物質[3],還含有豐富的細菌,尤其是乳酸菌,含有少量酵母菌和霉菌等類群微生物[4-6],鑒于環境保護和精深加工的需求,黃酒企業一直在探索米漿水的綜合、高效利用途徑。

近年來,乳酸菌在食品保藏、飼料行業、保健、醫療領域的應用價值被深入挖掘[7-9],我國傳統發酵食品蘊含豐富的乳酸菌資源,黃酒米漿水中富含乳酸菌,其代謝產物對黃酒的發酵過程、風味產生及營養價值產生影響[4,6,10]。已有我國傳統發酵食品如泡(醬)菜、發酵乳制品中具有抑菌活性乳酸菌的研究報道[11-12],鑒于乳酸菌基因組的多樣性大多與其所在的環境有關,尤其與抗生素抗性、糖代謝、蛋白質水解和限制性修飾等功能相關的基因與環境特異性相關[13],亟需深入認識黃酒米漿水中抑菌乳酸菌的類型及生理特性、抑菌物質的理化特性等。革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)的化學組成、生理生化特性不同,有些抑菌物質不能同時對G+和G-有抑制作用,比如成瀟龍等[14]研究發現米漿水對金黃色葡萄球菌(G+)有抑菌作用,故本文以致食品腐敗菌蠟樣芽胞桿菌(G+)和大腸桿菌(G-)為指示菌,對黃酒米漿水中具有抑制G+和G-的乳酸菌進行篩選,并對其特性進行初步分析,為米漿水的開發和綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒米漿水 會稽山紹興酒股份有限公司;大腸桿菌(E.coli,ATCC44102)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus,AS1.2238) 浙江省微生物研究所;MRS培養基、胰酪大豆胨培養基、營養瓊脂培養基、瓊脂粉、微生物生化反應管 杭州微生物試劑有限公司;CaCO3成都市科龍化工試劑廠;乳酸菌篩選培養基 含0.3% CaCO3MRS固體培養基;乳酸菌活化培養基 MRS液體培養基;乳酸菌保藏培養基 含2%瓊脂粉的MRS固體培養基;大腸桿菌活化及培養培養基 營養瓊脂培養基;蠟樣芽孢桿菌活化及培養培養基 胰酪大豆胨培養基;2%素瓊脂 瓊脂粉20 g,蒸餾水1 L。

YM30Z滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LRH-250恒溫培養箱 國華儀器有限公司;PHS-25酸度計 上海理達儀器廠;PL303電子分析天平 CX31光學顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司;梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺式高速冷凍離心機 Biofuge Primo R。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的初篩 采用溶鈣圈法[15],取100 μL適當稀釋的米漿水涂布于MRS培養基中,37 ℃培養24～48 h,挑取具有透明溶鈣圈、形狀不同的單個菌落。

1.2.2 抑菌乳酸菌的篩選 參照王偉[16]的方法,首先采用牛津杯法篩選對大腸桿菌和蠟樣芽胞桿菌有抑菌活性的乳酸菌,接著通過過氧化氫酶實驗篩選過氧化氫酶陰性菌株,所選菌株于MRS固體培養基上保藏,備用。

1.2.3 乳酸菌形態觀察及生理生化鑒定

1.2.3.1 菌株形態 將純化的有溶鈣圈的菌株接種于MRS平板上,37 ℃培養2 d,革蘭氏染色后顯微鏡觀察,挑取形態不一致菌株,編號,保藏。

1.2.3.2 生理生化鑒定 按半乳糖、乳糖、松三糖、棉子糖、麥芽糖、葡萄糖、七葉苷、馬尿酸鈉、葡萄糖產氣、淀粉水解、精氨酸雙水解、吲哚反應、明膠液化生化鑒定管的要求接種乳酸菌,考察乳酸菌的生理生化特性[17-18]。

1.2.4 乳酸菌抑菌活性的測定 將大腸桿菌接種于營養瓊脂基液體培養基,37 ℃恒溫培養24 h;蠟樣芽孢桿菌接種于胰酪胨大豆液體培養基,30 ℃恒溫培養24 h;采用牛津杯法[16]考察乳酸菌上清液對指示菌的抑菌性能。

1.2.5 有機酸干擾的排除 參照王偉[16]的方法略有改動,用1 mol/L的NaOH將離心后的發酵液pH調節至5.0,同時分別用乳酸、乙酸和鹽酸調節MRS液體培養基pH至5.0作為對照;采用牛津杯法考察乳酸菌發酵上清液、乳酸、乙酸和鹽酸對指示菌的抑制活性。

1.3 數據處理

每組實驗進行3個平行,用SPSS進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離及部分形態

從黃酒米漿水中篩選出具有抑菌活性的乳酸菌菌株36株,其菌落形態為圓形,乳白色,表面光滑,邊緣齊整,不透明,質地均勻,菌體無鞭毛,無芽孢產生,菌落周圍有融鈣圈。顯微鏡下,均為桿菌,只是菌株的長寬不一;革蘭氏染色后有些菌株呈紫色,有的菌株呈紅紫色,說明細胞壁肽聚糖和類脂質含量有差異。菌落形態及顯微鏡下菌體形態見圖1和圖2。

圖1 乳酸菌菌落及融鈣圈Fig.1 LAB colony and calcification ring

圖2 幾株乳酸菌在顯微鏡下的菌體狀態(400×)Fig.2 The shape of several strains of the lacticacid bacteria under the microscope(400×)

2.2 乳酸菌生理生化特性

對分離得到的36株菌進行生理生化鑒定,從表1可見,36株乳酸菌均能利用葡萄糖、七葉苷及麥芽糖,精氨酸雙水解試驗、吲哚反應、明膠試驗、葡萄糖產氣、淀粉水解都為陰性,由葡萄糖產氣為陰性得出36株乳酸菌均為同型發酵乳酸菌,也就是說這些菌株發酵己糖幾乎全生成乳酸[16]。

表1 乳酸菌生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical properties of the LAB

參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17],36株乳酸菌均為乳桿菌屬,R1、R6、R8與植物乳桿菌(L.plantarum)特征一致,R3與微小乳桿菌(L.minor)生化反應相似度極高,R4、R33與鳥乳桿菌不解棉籽糖亞種乳桿菌(L.aviariussubsp.araffinosus)特征一致,R7、R35與鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)特征一致,R10、R15、R30與馬乳酒樣乳桿菌(L.kefiranofaciens)特征一致,R11、R13、R16、R18、R19、R20、R22、R24、R25、R27、R36與卷曲乳桿菌(L.crispatus)特征一致,R17、R21、R23、R28、R31、R34與嗜酸乳桿菌(L.acidlophilus)特征一致。菌株R2、R5、R9、R12、R14、R26、R29、R32無法確定,其中R2、R5、R9三者特征一致,R12與R32特征一致,R14、R29、R26三者不相同,這36株菌中唯獨R26不能使馬尿酸鈉產生沉淀。這36株菌均為乳桿菌屬,與毛青鐘等[19]的報道相符合。

2.3 乳酸菌抑菌活性

以G+菌株蠟樣芽孢桿菌、G-菌株大腸桿菌為指示菌,36株乳酸菌的抑菌活性見表2。從表2可知,36株乳酸菌均對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌有抑制作用,以蠟樣芽孢桿菌為指示菌時,抑菌圈清晰,抑菌圈最大的菌株為R2,其直徑為18.14 mm,抑菌圈最小的菌株為R26,其直徑為13.72 mm;以大腸桿菌為指示菌時,抑菌圈不是很明顯,邊緣不清晰,抑菌圈最大的菌株為R3,其直徑為16.50 mm,抑菌圈最小的菌株為R15,其直徑為10.88 mm。

表2 乳酸菌抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of the LAB

從目前報道來看,大部分乳酸菌所產抑菌物質只對G+或G-有抑制效果,少部分乳酸菌如乳酸菌SD-22[20]、乳酸菌Y13、X29和X30[21]、植物乳桿菌HLJ-174[22]等既抑制G+,也抑制G-,乳酸菌SD-22還對部分真菌有抑制作用[20]。本研究分離出的36株乳酸菌既對G+蠟樣芽孢桿菌有抑制作用,也對G-大腸桿菌未有抑制作用,說明這些乳酸菌生理特征與現有報道有區別;另外,這可能就是浸米時間長釀得的酒,入壇后能夠久藏不壞的原因之一。

圖3 乳酸菌對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of the LABon B.cereus and E. coli注:A:蠟樣芽孢桿菌為指示菌;B:大腸桿菌為指示菌。

2.4 有機酸干擾的排除

目前發現乳酸菌的抑菌性主要依賴于其產生的代謝產物,這些物質主要有有機酸如乳酸、乙酸、蘋果酸等,蛋白或小肽如reuterin和bacteriocins[23-24],以及新型抑菌物質如苯乳酸、4-羥基苯乳酸[25-26]等,為了驗證該抑菌物質是乳酸、乙酸、鹽酸,還是有機酸外的某類物質,用乳酸、乙酸和鹽酸調節MRS液體培養基至pH5.0的抑菌效果見表3。

表3 三種有機酸在pH5.0時的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of threekinds of organic acids at pH5.0

從表3可見,乳酸、乙酸和鹽酸調節MRS液體培養基至pH5.0時,對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌均無抑菌活性;該結果與王偉[16]的研究報道相似。這說明乳酸菌發酵產生的抑菌物質并非是乳酸、乙酸和鹽酸等有機酸,而是由其它類型的抑菌物質組成的。

3 結論

本實驗在黃酒米漿水中分離得到36株對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌同時有抑菌作用的乳桿菌,初步判斷為植物乳桿菌、微小乳桿菌、鳥乳桿菌不解棉籽糖亞種乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌等。這36株乳桿菌產生的抑菌物質非乳酸菌發酵產生的乳酸、乙酸和鹽酸。黃酒米漿水中乳酸菌資源豐富,但是其生理特性、發揮的功能及代謝通路仍不清楚,本研究僅篩選了具有抑制細菌生長的乳酸菌,為黃酒米漿水中抑菌物質的研究提供了思路,但是對乳酸菌的特性、抑菌物質的類型等仍需深入研究,因為其不僅影響黃酒的品質,而且可能在食品保鮮、生物醫藥等領域發揮更大的作用。