重組疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶對面包烘焙品質的影響

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(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 2.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江杭州 310023)

脂肪酶(E.3.1.1.3)能夠催化甘油三酯水解成為甘油二酯、甘油一酯或甘油和游離脂肪酸。20世紀90年代后,人們探索并發現了脂肪酶在烘焙食品中的功能和應用價值。脂肪酶能夠增大面包體積、改善面包組織結構、增白面包芯等,且作為一種天然、“綠色”的生物制品,應用于面包中不會產生對人體有毒有害的物質。雙乙酰酒石酸單(雙)甘油酯(Diacetyl Tartaric Acid Ester Of Mono(Di)Glycerides,DATEM)雖然是一種廣泛使用的面包改良劑[1],但可檢測到化學物質的殘留[2]。在面包中的用量方面,由于脂肪酶的催化效率非常高,其用量僅為化學改良劑的1/500,大大降低了生產、運輸、儲存和使用成本[3]。

尋求烘焙可用的脂肪酶是目前的研究熱點。自然界中脂肪酶來源廣泛,微生物產生的胞外脂肪酶更具有開發和商業利用價值。張巒等[4]利用基因工程獲得的新型重組華根霉脂肪酶能顯著改善面包的烘焙品質。Paciello等[5]發現枯草芽孢桿菌脂肪酶A可增強面包風味。不同微生物來源的脂肪酶具有不同特性,在面包體系中發揮的功效也不同。疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase,TLL)是一種高活性、高穩定性及Sn-1,3位專一性的酶,在55～60 ℃可維持穩定酶活[6]。長期以來TLL得到了廣泛的關注與研究,主要是利用固定化方法進一步提高酶的利用率及穩定性,拓展其應用范圍,TLL的應用最早是面向食品工業,現在還用于生物柴油、對映體選擇等領域[7],而TLL在面包體系中的應用目前鮮有報道。僅有Castello等[8]報道Sn-1,3位專一性脂肪酶能夠改善面粉的脂質組成。本實驗室通過基因工程優化TLL基因(序列GenBank登錄號AF054513.1),經EcoR I/Not I雙酶切連接至表達載體pPIC9K的多克隆位點中,并將表達載體以同源重組的方式整合到畢赤酵母原始宿主菌GS115基因組中,實現了重組疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(RecombinantThermomyceslanuginosusLipase Produced byPichiapastoris,PTL)的高效表達,pNPP法測得高密度發酵后酶活可達24522.6 U/mL[9]。因此,PTL不僅能在各種條件下穩定發揮作用,還具有性價比高的優勢。

本研究基于脂肪酶對面包的三大主要作用,即增大面包比容、增白面包芯和改善組織結構,探究PTL的最佳使用量范圍,并闡明了不同用量脂肪酶對面包的影響。后分別取PTL、商業脂肪酶Lipopan F BG(以下簡稱FBG)以及DATEM推薦用量的中間值應用于面包體系,從面包比容、質構、感官評定等方面分析不同添加劑的作用特點,并采用掃描電鏡和頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法(Head-Space Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometer,HS-SPME-GC-MS)分別對面筋網絡結構及面包芯風味物質進行分析,為PTL在面包烘焙工業中的應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FBG 諾維信公司;高筋小麥面粉(不含任何食品添加劑) 河北金沙河面業公司;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;DATEM 鄭州裕和食品添加劑公司;黃油、食鹽、白砂糖等 市售;PTL 本實驗室制備;鋨酸 SPI-CHEM公司;戊二醛、PBS緩沖液、乙醇 國藥集團化學試劑公司。

和面機 廣東小熊電器有限公司;PRX-150B智能培養箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;SEC-2Y電烤爐 江蘇三麥食品機械有限公司;TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司;ColorFlex EX CFEZ2316色差儀 美國HunterLab公司;GeminiSEM 300掃描電鏡 德國ZEISS公司;HCP-2型臨界點干燥儀 Hitachi公司;57328-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司;7890B/5977A氣質聯用儀 安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 面包的配方及制備 面包基礎配方:高筋小麥粉100%,活性干酵母1%,蔗糖6.7%,食鹽1%,黃油5%,水60%(均以小麥面粉質量計)。未添加脂肪酶及DATEM的樣品為對照組。分別加入10、20、30、40 mg/kg PTL以研究面包中PTL的最佳用量。FBG的推薦用量為10～20 mg/kg[2],GB 2760-2014規定DATEM在焙烤食品中的用量不超過20 g/kg[10],取中間值,即PTL組和FBG組分別加入相應的脂肪酶15 mg/kg,DATEM用量為10 g/kg,以比較不同添加劑的使用效果。

面包制作工藝:干料混勻后加入水和黃油攪拌,搓圓整形,靜置(25 ℃,10 min),裝入模具(170 mm×80 mm×80 mm),醒發1 h(38 ℃、相對濕度為85%),烘烤30 min(上火180 ℃、下火220 ℃),得到成品面包,室溫冷卻1.5 h后用于分析測定。

1.2.2 面包比容測定 面包稱重,體積采用菜籽置換法測定。面包比容計算公式如下:

1.2.3 面包組織結構分析 取面包中心厚度為20 mm的切片(如圖1所示),使用NikonD7000數碼相機采集照片并用Image J軟件進行圖像分析。

圖1 面包切片取樣示意圖Fig.1 Schematic diagram of bread slice sampling

1.2.4 面包芯白度測定 取面包中心厚度為20 mm的切片。選擇L*a*b*色度標尺,測量L*值,該值表示面包芯白度,在0～100范圍內變化,0表示黑色,100表示白色。

1.2.5 掃描電鏡樣品制備 攪拌得到的面團樣品在2.5%的戊二醛溶液中固定12 h以上,用0.1 mmol/L PBS緩沖液漂洗,然后用1%的鋨酸溶液固定,再用0.1 mmol/L PBS緩沖液漂洗,最后用梯度濃度的乙醇溶液進行脫水處理。臨界點干燥后噴金鍍膜,置于掃描電鏡下觀察[11]。

1.2.6 面包質構測定 取面包中心厚度為20 mm的切片測定。參數設定為:測前速度2.0 mm/s,測試速度1.0 mm/s,測后速度1.0 mm/s,壓縮比為50%,P5型探頭。

1.2.7 面包芯風味物質分析 采用HS-SPME-GC-MS聯用技術[12]。準確稱取面包芯1.5 g,切碎,60 ℃頂空固相微萃取40 min。色譜柱:J&WHP-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持1 min,以6 ℃/min的速度升至160 ℃,最后以10 ℃/min的速度升至250 ℃,保持10 min;載氣(He)流量:1 mL/min;進樣溫度為250 ℃;進樣量1 μL;不分流。揮發性風味物質化合物的定性及相對定量分析:GC-MS結果經計算機NIST Library相匹配,定性檢索圖譜峰,采用面積歸一化法計算相對百分含量。

1.2.8 感官評定 隨機選取28名不同年齡階段(20～40歲)、不同民族、未經過專業感官評定訓練的人員通過九點嗜好法[13]對4組面包(對照組、PTL組、FBG組、DATEM組)進行感官評定,評判內容包括面包外觀、內部組織結構、酸度、氣味、味道、口感和整體接受度,評分細則見表1。

表1 九點嗜好法感官評分細則Table 1 Nine-point hedonic scalefor sensor evaluation of bread crumb

1.3 數據處理

試驗數據均以重復試驗的平均值±標準差(Means±SD)表示。使用SPSS 22.0軟件和Graphpad Prism 8.0.2軟件進行統計分析和繪圖。各組之間差異比較采用One-way ANOVA中的Tukey多重比較法檢驗顯著性,P<0.05判斷為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 PTL對面包比容的影響

由圖2可知,PTL添加量為10和20 mg/kg時,面包比容顯著高于對照組(P<0.05),分別增加了10.1%和10.8%。面包體積與面筋網絡強度、持氣性等有關。Poulsen等[14-15]指出,脂肪酶水解甘油三酯產物單/雙甘油酯是良好的乳化劑,能與谷蛋白更好地結合并加強對面筋網絡的橋架作用。魏巍[16]發現脂肪酶添加量為15～25 mg/kg時面包比容較大。本試驗中隨著PTL用量增加(>20 mg/kg),面包比容呈下降趨勢。這與Si等[17]的觀點相一致,過量脂肪酶會造成面包體積增加量的減少。有學者認為這與脂肪酶廣泛的水解作用有關[18]。水解產生過量脂肪酸對面團體系具有負面影響,面團筋力過強抑制了面團發酵過程的體積膨大[18]。另外,Gerits等[20]認為脂肪酶過量導致氣孔發生部分合并,在不斷增大的壓力下面包的體積膨大提前終止。綜上,適量的PTL能顯著改善面包的比容特性(P<0.05),10～20 mg/kg為最佳添加量。

圖2 PTL用量對面包比容的影響Fig.2 Effect of PTL addition on specific volume of bread注:不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05);圖4同。

2.2 PTL對面包組織結構的影響

組織結構決定了面包的口感,可間接反映面包的持氣率和穩定性,與面包體系中面筋網絡強度有關。烘焙階段溫度達到60 ℃時淀粉發生糊化并硬化,面團由半固體泡沫狀轉化為固體海綿狀,多孔結構形成。一般地,面包芯中氣孔分布均勻、氣孔面積占比大,說明面包組織結構佳。

由圖3可知,未添加PTL的面包中尺寸大的氣孔較多,氣孔壁較厚,組織結構較粗糙。加入PTL后面包單位面積氣孔增多,且用量為30 mg/kg時氣孔密度顯著大于對照組(P<0.05)(見表2)。氣孔面積占比隨PTL用量的增加,呈現先增大后減小的趨勢。王雨生等[19]也發現添加脂肪酶能使面包內部結構更細膩,網孔大小一致且尺寸較小。王學東等[21]發現20 mg/kg脂肪酶改善面包內部組織結構效果最好。脂肪酶用量過多會造成面筋強度過大,氣孔面積減小。因此,PTL用量為10～20 mg/kg時,面包組織結構較佳。

表2 PTL添加量對氣孔結構的影響Table 2 Effect of PTL addition on structure of gas cell

表4 不同添加劑對面包質構的影響Table 4 Effect of different additives on bread texture

圖3 PTL用量對面包組織結構的影響Fig.3 Effect of PTL addition on crumb texture注:A～E分別代表PTL用量為0(對照組)、10、20、30、40 mg/kg。

2.3 PTL用量對面包芯白度的影響

脂肪酶對面包芯的增白作用可通過多種途徑實現:一是水解脂質使其中的色素溶出同時釋放脂肪酸,脂肪酸在脂肪氧化酶的作用下產生過氧化物進一步氧化色素(如胡蘿卜素等),從而達到二次增白效果[22]。二是通過改善面包芯的組織結構,使之更加細膩、均勻而實現視覺上的增白[23]。有報道稱,面包芯白度與組織結構(影響光反射)有關[24]。盡管PTL能夠顯著改善面包組織,用量為30 mg/kg時氣孔密度最大,氣孔面積占比較大(見2.2),對應的L*值也較大。然而,脂質氧化程度受原料本身及其混合條件等多種因素的影響[25-27]。表3中,不同PTL用量的面包芯L*值與對照組無顯著差異(P>0.05),可能是面粉中脂肪氧化酶的活力水平較低導致脂肪酶的增白效果不顯著,李守宏等[23]也有此發現。

表3 PTL用量對面包芯白度的影響Table 3 Effect of PTL addition on crumb luminosity

2.4 不同添加劑對面包比容的影響

上述試驗明確了PTL的最佳用量范圍為10～20 mg/kg。進一步研究比較PTL、FBG和DATEM對面包品質的影響并評價PTL的使用效果。

如圖4所示,PTL和FBG均顯著提高了面包比容(P<0.05),較對照組分別增加了9.8%和11.9%。脂肪酶的作用效果取決于其對脂質的水解程度及水解產物組成。De Maria等[28]認為,最“完美”的脂肪酶應該對甘油三酯、磷脂和半乳糖脂這三種底物都具有適當的活性。然而,目前還不清楚何種脂肪酶可被稱為最“完美”的以及每類脂質該水解到何種程度。Gerits等[18]用不同特異性的脂肪酶改變小麥內源性脂類的組成,發現面包體積的增加與半乳糖脂和磷脂含量的降低有關。相應地,Chung等[29]也發現面包比容與極性組分的含量呈顯著正相關。至今,烘焙行業已經歷了三代商品脂肪酶[2,30],FBG屬于第二代,其優勢是對極性和非極性脂類均有水解作用能產生更多極性組分,包括溶血卵磷脂和單半乳糖甘油二酯,因此FBG對面包比容的提高效果優于PTL。

圖4 不同添加劑對面包比容的影響Fig.4 Effect of different additives on specific volume of bread

本試驗中,DATEM對面包比容無顯著增大作用(P>0.05)。有學者認為,由脂肪酶產生的“表面活性劑”與直鏈淀粉形成復合物的親和力高于DATEM[31-33]。此外,DATEM是一種復雜的混合物,DATEM的作用隨其組成成分的不同而改變,且對于蛋白含量不同的面粉作用效果不同[34-35]。張巒等[36]在面包中添加0.5%DATEM使得其比容顯著增加。而Gerits等[20]認為DATEM對面包體積的影響不具有劑量依賴性。

2.5 不同添加劑對面團微觀結構的影響

原料混合階段,面粉中的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白通過二硫鍵與氫鍵相互作用形成面筋網絡,淀粉顆粒鑲嵌在該結構中,同時空氣混入面團體系中形成一個個氣孔。有報道稱,面團發酵階段不會形成新的氣孔,酵母產生的CO2只能擴散并填充到現存的氣孔中,因此面筋網絡及氣孔的形成對于面包組織結構非常重要[3,37]。在原料混合階段,面筋網絡是負責穩定氣孔、保證持氣性的主要(甚至是唯一)因素[18]。

由圖5可以看出,對照組面團掃描電鏡(SEM)圖中有較多大小不一的淀粉顆粒暴露在外,沒有形成連續的面筋網絡,還可看到斷裂的、成片狀的面筋膜。PTL組和FBG組均有大范圍的面筋束出現,淀粉顆粒鑲嵌在其中,且FBG組的面筋網絡中還包括了小范圍的絲狀連接,縱橫交錯地將淀粉顆粒串聯起來,結構更為細膩、有韌性,這可能與FBG水解生成更多的極性脂類有關。有研究稱,面筋網絡中超過一半的淀粉顆粒與極性脂類相結合[38],極性脂質能通過降低蛋白聚合物的靜電斥力而提高聚合力,增強面筋網絡并間接穩定氣孔結構。DATEM組面團中沒有出現大范圍的絲狀面筋網絡,但與對照組相比淀粉顆粒更緊密地團簇在一起,也沒有斷裂的面筋膜出現。有報道稱,脂肪酶水解產物與DATEM作為乳化劑的作用機制存在一定差異:DATEM在原料混合階段直接改變脂質組成,且與其他外源性脂質相互競爭和谷蛋白作用[39]。而脂肪酶水解脂類是一個過程[20],更有利于面筋反應的動態平衡和有序排列[40]。因此,從面筋的掃描電鏡結果來看,FBG增強面筋網絡的效果最好,PTL次之,DATEM稍勝于對照組,且上述結果直接反映在面包比容特性上(圖2,圖4)。

圖5 不同添加劑對面團微觀結構的影響(600×)Fig.5 Microstructure of doughs in thepresence of different additives(600×)注:A～D分別為對照組、PTL組、FBG組、DATEM組。

2.6 不同添加劑對面包質構的影響

面包質構是直接反映面包品質的重要指標之一。硬度與面包品質呈負相關[41]。如表4所示,脂肪酶PTL和FBG能使面包硬度顯著降低(P<0.05)。當形成直鏈淀粉-脂質復合物時,表面活性劑能有效防止面包變硬[42]。脂肪酶水解甘油三酯產生的小分子產物與淀粉結合,有效阻止了淀粉分子的重結晶[3]。膠著性、咀嚼性與面包品質呈負相關,三種添加劑都有改善效果,其中FBG組面包口感最好。內聚性和回復性與面包品質呈正相關[42],PTL對這兩個指標改善最大,但可能受烘焙因素的影響,一定程度上掩蓋了其使用效果。綜上,PTL能夠顯著降低面包硬度(P<0.05),僅次于FBG,還能對內聚性和回復性有一定程度的改善。

2.7 面包芯風味物質分析

面包芯的風味物質中乙醇所占比例最大,與許多研究結果一致[43-44],從高到低依次為PTL組(57.7%)、DATEM組(37.9%)、對照組(28.4%)、FBG組(25.0%)。酯類物質化合物大部分表現為果香及花香[45],對面包香氣有較大的貢獻。加入脂肪酶(PTL及FBG)后,面包的呈香成分明顯增多,FBG組酯類含量明顯高于其余三組。Paciello等[5]發現枯草芽孢桿菌脂肪酶A能增強面包總體香氣。對照組、PTL組、FBG組、DATEM組面包芯中分別檢出酯類物質1、1、5、2種,烴類物質9、10、12、5種。據報道,烴類物質芳香閾值較高,但其中有些是產生雜環化合物的重要中間體,有利于提升面包的整體香氣[46]。關于酸類物質,只有DATEM組中檢測到了乙酸存在,且含量較高為25%。醛酮類和雜芳環類的含量及香氣閾值較低,對面包香氣有較大影響,在各組面包芯中成分差異較大。其中,正己醛在對照組中含量最高,與Pico等[47]研究一致,被認為是脂質氧化產生;2-戊基呋喃具有豆香、泥土香及類似蔬菜的香味[47],FBG組中沒有檢出。面包芯的整體香味是復雜的風味物質綜合作用的結果,進一步通過感官評定分析評估。綜上,加入脂肪酶PTL能夠增加風味物質的種類及相對含量。

圖6 面包芯的風味物質Fig.6 Flavor compounds in bread crumb

2.8 感官評定

九點嗜好法產生的感官評定得分反映的是消費者的喜愛程度與購買傾向,與面包品質存在一定但非必然的關聯。在面包外觀、味道、酸度、口感、整體接受度這5個方面,FBG組最受喜愛,PTL組次之,DATEM組得分較低。其中,DATEM組酸度評分(5.96分)低于對照組(6.21分),可能與GC-MS檢測出大量乙酸有關。在面包中使用DATEM產生酸味是一個普遍存在的現象,然而不影響對面包的整體接受度,這與Moayedallaie[2]的報道觀點相一致。另外,有研究稱酸類可增強面包的味道和口感[48]。PTL組面包的內部組織結構(6.82分)和氣味(6.48分)嗜好得分最高,說明PTL在改善面包品質方面具有其獨特優勢。

圖7 感官評定雷達圖Fig.7 Radar map of sensory tests

3 結論

適量PTL能夠增加面包體積及改善組織結構,最佳用量為10～20 mg/kg。過量PTL造成面包比容下降,氣孔面積占比減小等不良影響。本試驗中PTL對面包芯增白作用不顯著(P>0.05),可能是受原料及其混合條件等限制。取不同添加劑(酶制劑和化學改良劑)的推薦用量中間值應用于面包發現,FBG在增大面包比容、強化面筋結構、提高感官整體接受度等方面效果最好,PTL次之,DATEM較差。且不同添加劑對面包質構具有不同影響,加入PTL后面包硬度顯著降低(P<0.05),對內聚性和回復性也有一定程度的改善。GC-MS測定面包芯風味物質結果顯示,脂肪酶FBG和PTL都能夠明顯增加風味物質的種類。加入DATEM產生大量乙酸掩蓋了面包的香氣。經九點嗜好法感官評定,PTL組面包在氣味及組織結構方面得分最佳,分別為6.48分和6.82分。綜上,PTL能有效改善面包的烘焙品質且具有不同于FBG的獨特優勢,這將為其在烘焙工業中的應用提供參考。