不同發酵方法對發酵銀杏粉營養和風味的影響

(江蘇農牧科技職業學院食品科技學院,江蘇泰州 225300)

銀杏(Ginkgobiloba)是一種珍貴的藥食同源資源,其種仁含有蛋白質、淀粉、脂肪、粗纖維、維生素、微量元素等營養成分及銀杏黃酮、銀杏多糖等具有特殊功能的微量活性物質[1]。銀杏果具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力、治療心血管疾病等功效[2]。泰州是銀杏之鄉,擁有豐富的銀杏資源,但開發利用較低,人們常將剝皮的銀杏果作為煲湯燉菜的原料,雖然也小規模生產銀杏奶茶、銀杏酒、銀杏月餅、銀杏保健餐粉等產品,但巨大的產能和落后的生產技術之間的矛盾巨大,造成了大量銀杏資源的浪費,因此,有必要加大銀杏資源的開發和利用。

微生物發酵可產生復雜的酶系,對外源性底物進行結構的修飾和轉化,產生眾多活性成分和風味物質,提高產品的營養價值,改善產品風味[3]。乳酸菌和酵母菌是淀粉類原料發酵過程中常用的優勢菌[4],乳酸菌與酵母菌之間存在共生與互補效應,酵母菌的代謝產物氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等可刺激乳酸菌活動,為乳酸菌提供營養物質,乳酸菌水解產物則為酵母菌提供了能量來源[5]。乳酸菌和酵母菌共生發酵制得的發酵乳飲料的蛋白水解程度、多肽抗氧化活性和感官均高于單一菌種發酵的結果[6];閆彬等[7]的研究表明:乳酸菌和酵母菌混合培養比單菌培養能得到更多的風味物質和甲酸、乙酸和丙酸;Tristezza等[8]的研究表明:乳酸菌和葡萄酒酵母混合發酵會縮短葡萄酒發酵時間,生成丁二酸二乙酯和乳酸乙酯,使葡萄酒具有黃油和奶油香味;李美倫等[4]利用植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母混合發酵制作的米發糕相比較傳統市售米發糕產生了12種特有風味物質,其中9種為酯類物質;劉英麗等[9]的研究表明,乳酸菌和酵母菌復配使用后醇類揮發性物質含量增多,并產生四甲基吡嗪物質。但未見銀杏果通過生物發酵技術提高其營養功能和風味的報道。

本試驗以乳酸菌和酵母菌為發酵劑,研究了不同的發酵方法組合對發酵銀杏粉中的黃酮類物質、多酚類物質、可溶性蛋白質、可溶性糖、總抗氧化能力、揮發性香氣成分的影響機理及變化規律,以期為地方銀杏資源的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

銀杏(大佛指) 泰州利群超市;淀粉酶、糖化酶 北京索萊寶科技有限公司;乳酸桿菌菌株SM-006 江蘇農牧科技職業學院實驗室選育,菌種為凍干菌粉;酵母菌 安琪酵母股份有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)測試盒 青島捷世康生物科技有限公司;沒食子酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸、乙醇、碳酸氫鈉、磷酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、福林酚試劑、碳酸鈉、苯酚、葡萄糖 等化學試劑均為國產分析純。

7980B-5977A GC-MS氣質聯用儀 美國安捷倫科技公司;50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭 美國Supelco公司;T6-紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;RE-52D旋轉蒸發儀 上海青浦滬西儀器廠;DHG-9101-2S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發科學儀器有限公司;Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;5PX-250S·Ⅱ生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵銀杏粉的制備 新鮮銀杏果去殼后預煮1 h,置于2‰的碳酸氫鈉溶液浸泡2 h,于1‰鹽酸溶液浸泡15 min,然后冷熱水交替浸泡10 min,于清水中浸泡12 h后去芯,搗碎,于70 ℃的烘箱內干燥12 h。稱烘干后的粉碎樣100 g,溶于600 mL純凈水中,膠體磨研磨3 min,置于沸水浴中加熱至100 ℃,保持15 min使淀粉充分糊化,取出后冷卻至25 ℃,分別按照單酶解(M)、酶解+乳酸菌(M+R)、單乳酸菌(R)、乳酸菌+酵母菌(R+J)、酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)的工藝進行發酵,工藝條件如下:

單酶解(M):加入2‰和1‰的糖化酶和淀粉酶,于60 ℃的恒溫水浴振蕩器中攪拌酶解2 h后冷卻至25 ℃。

酶解+乳酸菌(M+R):在單酶解的基礎上,加入3 g/100 g乳酸菌凍干菌粉,攪拌均勻,30 ℃的恒溫培養搖床發酵12 h。

單乳酸菌(R):以3 g/100 g的量加入乳酸菌凍干菌粉,攪拌均勻,30 ℃的恒溫培養搖床發酵12 h。

乳酸菌+酵母菌(R+J):分別加入1.5 g/100 g乳酸菌凍干菌粉和酵母菌粉,攪拌均勻,30 ℃的恒溫培養搖床發酵12 h。

酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J):在單酶解的基礎上,分別加入1.5 g/100 g乳酸菌凍干菌粉和酵母菌粉,攪拌均勻,30 ℃的恒溫培養搖床發酵12 h。

分別取出發酵液倒入平皿,保鮮膜封口后放入-70 ℃冰箱冷凍2 h后放入冷凍干燥機內凍干28 h,即為發酵銀杏粉成品。

1.2.2 黃酮含量的測定 稱取發酵銀杏粉15 g,加入150 mL 70%乙醇配制成溶液,70 ℃水浴回流提取2 h,常溫下6000 r/min離心15 min,上清液放入旋轉蒸發儀,蒸發濃縮后轉移至50 mL容量瓶,30%乙醇定容至刻度。以蘆丁為標樣,采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法[10]測定發酵銀杏粉中黃酮含量。標準曲線方程為:y=8.9943x+0.0042(0～0.08 mg/mL,R2=0.9987),x為蘆丁濃度,(mg/mL);y為吸光度。發酵銀杏粉中黃酮含量(mg/g)=m1/m。式中:m1為樣品中黃酮質量(mg),m為發酵銀杏粉的質量(g)。

1.2.3 多酚含量的測定 稱取發酵銀杏粉2 g,加入50 mL 60%乙醇浸泡1 h,于90 ℃恒溫水浴鍋內提取2 h,反復提取3次。提取液7200 r/min離心20 min,取上清液真空濃縮,得多酚提取液[11]。以沒食子酸為標樣,采用福林酚法測定發酵銀杏粉中多酚含量。標準曲線方程為y=1.9562x+0.0135(0～0.3 mg/mL,R2=0.9995),x為沒食子酸濃度(mg/mL);y為吸光度。發酵銀杏粉中多酚含量(mg/g)=m2/m。式中:m2為樣品中多酚質量(mg),m為發酵銀杏粉的質量(g)。

1.2.4 可溶性蛋白含量的測定 取發酵銀杏粉0.5 g,加入Tris-HCl緩沖液25 mL,磁力攪拌提取0.5 h,于4 ℃、7000 r/min離心15 min,取上清液。以牛血清血蛋白為標樣,采用考馬斯亮藍法進行測定發酵銀杏粉中可溶性蛋白質含量。標準曲線方程為:y=5.1664x+0.0108(0～0.06 mg/mL,R2=0.9992),x為牛血清血蛋白濃度(mg/mL);y為吸光度。發酵銀杏粉中蛋白質含量(mg/g)=m3/m。式中:m3為樣品中蛋白質質量(mg),m為發酵銀杏粉的質量(g)。

1.2.5 可溶性多糖含量的測定 取發酵銀杏粉1 g,加入50 mL蒸餾水,60 ℃水浴回流提取2 h,于4000 r/min離心10 min,取上清液。以葡萄糖為標樣,采用苯酚硫酸法進行測定發酵銀杏粉中多糖含量。標準曲線方程為:y=2.4957x+0.0238(0～0.06 mg/mL,R2=0.9993)。x為葡萄糖濃度(mg/mL);y為吸光度。發酵銀杏粉中可溶性多糖含量(mg/g)=m4/m。式中:m4為樣品中可溶性多糖質量(mg),m為發酵銀杏粉的質量(g)。

1.2.7 揮發性風味物質的測定 樣品處理:稱取3 g樣品于固相微萃取樣品瓶,60 ℃恒溫加熱平衡10 min,插入老化好的SPME固相微萃取萃取頭(老化條件250 ℃,2 h),于60 ℃頂空吸附30 min,于氣相色譜儀250 ℃解吸3 min。

GC-MS條件:色譜柱Hp-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為He,流速1.2 mL/min,不分流進樣;進樣口溫度為230 ℃;溶劑延遲3 min;程序升溫:初始溫度20 ℃,保持5 min;以2 ℃/min升至30 ℃,保持3 min;以10 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。

MS條件:電離模式:EI,70 eV;離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,傳輸線溫度250 ℃,全掃描模式,掃描范圍:35～550 m/z。

定性分析:GC-MS檢測到的揮發性香氣物質與NIST 14.L譜庫進行匹配,匹配度≥80%的鑒定結果予以保留。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同發酵方法對營養成分的影響

2.1.1 不同發酵方法對黃酮含量的影響 黃酮類物質是銀杏果仁中的主要活性成分,常與糖結合,以黃酮苷的形式存在[12]。不同發酵方法對黃酮含量的影響見圖1。由圖1可知,M+R+J組(17.06±0.82) mg/g最高,M+R組(13.91±0.58) mg/g、M組(13.05±0.89) mg/g均顯著高于R+J組(8.02±0.33) mg/g和R組(8.05±0.52) mg/g(P<0.05),主要是由于糖化酶和淀粉酶水解了樣品中的糖,打斷糖苷鍵,釋放出黃酮物質所致;M組和M+R組黃酮含量差異不顯著,這是因為乳酸菌發酵底物為乳糖和葡萄糖,而黃酮類物質主要與多糖結合,所以乳酸菌發酵對黃酮含量影響不顯著;M+R+J組黃酮含量最高,且顯著高于M組和M+R組(P<0.05),主要由于酵母菌產生了纖維素酶、果膠酶、糖苷酶等,降低了細胞壁和糖苷鍵對黃酮類物質的阻滯所致[13]。

圖1 不同發酵方法對黃酮含量的影響Fig.1 Effects of different fermentationmethods on flavonoid content注:不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 不同發酵方法對發酵銀杏粉中多酚含量的影響 多酚類物質是指分子結構中有若干個酚性羥基的植物成分總稱,具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性。銀杏果仁中的多酚類物質主要是黃酮類、酚酸類等[11]。不同發酵方法對多酚含量的影響見圖2。由圖2可知,5組多酚含量差異顯著(P<0.05),M+R+J組(46.62±1.97) mg/g最高,顯著高于R+J組(38.64±2.63) mg/g(P<0.05)。這是由于多酚化合物通過疏水鍵和多元氫鍵與蛋白質、生物堿、多糖等生物大分子以結合態存在[14]。糖化酶和淀粉酶可水解樣品中的多糖為可溶性糖,酵母菌和乳酸菌可分解大分子蛋白質為多肽和小分子可溶性蛋白質,使結合態的多酚類物質溶出。M+R組(31.92±1.21) mg/g顯著低于M組(35.16±1.69) mg/g(P<0.05),R組(25.67±1.09) mg/g最低,這是由于乳酸菌發酵樣品中糖類物質產生乳酸,抑制多酚氧化酶活性,減少多酚類物質的分解所致。

2.1.3 不同發酵方法對可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白指可以小分子狀態溶于水或其他溶劑的蛋白,可溶性蛋白易被人體消化利用,是評價食品營養價值的重要指標之一。不同發酵方法對可溶性蛋白含量的影響見圖3。由圖3可知,M+R+J組(4.74±0.18) mg/g最高,與R+J組(4.59±0.12) mg/g差異不顯著,兩者顯著高于M+R組(3.42±0.09) mg/g和R組(3.28±0.15) mg/g(P<0.05),M組(1.41±0.11) mg/g最低。主要由于乳酸菌和酵母菌發酵過程中均會產生蛋白酶,將產品中的蛋白質水解為具有一定空間結構但分子量較小的蛋白質,增加了蛋白質的溶解性[15]。乳酸菌產生的乳酸具有α-羥基結構的羧酸,能與多肽鏈上的基團形成氫鍵,也會促進蛋白質的溶出[16]。

圖3 不同發酵方法對可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of different fermentationmethods on soluble protein content

2.1.4 不同發酵方法對可溶性糖含量的影響 可溶性糖是食品重要品質指標之一,賦予產品甜味,易于人體消化吸收。不同發酵方法對可溶性糖含量的影響見圖4。由圖4可知,5組產品中可溶性糖含量差異顯著(P<0.05),M組(18.98±0.66) mg/g含量最高,這是由于糖化酶和淀粉酶均能水解淀粉和糊精為可溶性葡萄糖所致;M+R組(11.25±0.85) mg/g含量次之,是由于乳酸菌可以利用樣品中的葡萄糖、果糖等可溶性糖發酵產生乳酸、乙醇等,使可溶性糖顯著下降的同時,賦予產品特殊的風味;M+R+J組(7.61±0.91) mg/g顯著低于M+R組(P<0.05),這是由于酵母菌不但可以消耗樣品中的葡萄糖、果糖、麥芽糖等可溶性糖,乳酸菌發酵產生的乳酸還能促進酵母菌大量繁殖[7],進一步消耗樣品中可溶性糖。R組(5.24±0.52) mg/g和R+J組(3.82±0.41) mg/g之間含量差異顯著(P<0.05)也進一步說明了這一機理。

圖4 不同發酵方法對可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of different fermentationmethods on soluble sugar content

圖5 不同發酵方法對總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig.5 Effects of different fermentation methodson total antioxidant capacity(T-AOC)

綜上所述,M+R+J組的黃酮類物質、多酚、可溶性蛋白、總抗氧化能力均最高,且黃酮類物質、多酚、總抗氧化能力顯著高于其他4組(P<0.05);可溶性糖含量雖不是最高,但由于乳酸菌發酵產生了乳酸、乙醇等物質,賦予了產品柔和的酸味和濃郁的香氣。

2.2 不同發酵方法對揮發性風味成分的影響

香氣是食品的重要品質特征,由多種揮發性風味成分組成。不同發酵方法能產生一些有益風味物質,降低某些風味缺陷物質的含量,改變發酵產物的風味特征,提高產品品質[19]。將不同發酵方法制得的發酵銀杏粉經處理后用氣質聯用儀結合計算機檢索技術對風味成分進行鑒定,結果見表1。

由表1可知，不同發酵方式制得的發酵銀杏粉中風味物質數目和相對含量(某風味物質占整體風味物質的比例)不同，共檢測出102種風味物質，其中烴類45種，醇類17種，酯類12種，酸類11種，醛類9種，酚類4種，其他類4種。

表1 不同發酵方法制得的發酵銀杏粉中揮發性風味成分含量Table 1 Contents of volatile flavor components in fermented Ginkgo biloba powder prepared by different fermentation methods

續表

續表

烴類化合物通常具有清香和甜香的風味，對整體風味有一定的貢獻[20]。但飽和烴類具有較高的嗅覺閾值，對產品風味貢獻較小。5種發酵方式制得的發酵銀杏粉中烴類化合物相對含量均較高，但種類和數量差異較大。M組檢測到16種烴類，相對含量41.95%，其中飽和烴類占全部烴類的比例為62.2%；R組檢測到13種烴類，相對含量25.34%，其中飽和烴類占全部烴類的比例為90.6%；R+J組檢測到10種烴類，相對含量18.23%，其中飽和烴類占全部烴類的比例為69.6%；M+R組檢測到17種烴類，相對含量31.67%，其中飽和烴類占全部烴類的比例為80.0%；M+R+J組檢測到18種烴類，相對含量30.10%，其中飽和烴類占全部烴類的比例為81.6%。乳酸菌參與發酵的產物中飽和烴類占全部烴類的比例均明顯提高，可能由于飽和烴類是雜環物質的中間體，來源于脂肪酸烷氧基的均裂[21]，而乳酸菌代謝產物中含有促進脂肪酸烷氧基均裂的酶。

醇類物質一般存在于植物中，通常具有芳香和植物香的風味[22]。5種發酵方式制得的銀杏粉中醇類物質種類和相對含量差異較大。M組檢測到5種醇類，相對含量10.31%；R組檢測到6種醇類，相對含量7.92%；R+J組只檢測到1種醇類，相對含量2.38%；M+R組檢測到5種醇類，相對含量8.72%；M+R+J組檢測到7種醇類，相對含量最高為17.44%，其中獨有成分2-3-丁二醇占全部醇類物質的比例為50.1%。2-3-丁二醇是4-甲基吡嗪的重要前體物質，吡嗪類物質具有青椒的香氣和焙烤香，起著助香的作用[23]。

醛類物質分為飽和醛和不飽和醛。5種發酵方式生產的發酵銀杏粉中的飽和醛除苯甲醛、2-壬烯醛、2-十二烯醛外，都屬于飽和直鏈醛。飽和直鏈醛通常有令人不快、辛辣的、尖刺的氣味[22]。M組中飽和醛相對含量最高，達11.90%，R、R+J、M+R組中飽和醛相對含量分別為9.52%、9.52%、7.14%，M+R+J組中飽和醛相對含量最低，只有2.38%，風味最清爽，聞不到刺激性氣味。發酵銀杏粉中不飽和醛主要是烯醛類化合物，烯醛類化合物通常具有清香、暗香，似亞麻油或奶油香的氣味[23]。烯醛類化合物只有R組(2.38%)和M+R組(2.37%)中有，但含量均較低，對整體風味影響不大。

酚類化合物能夠增加香氣的豐滿性，且具有一定的抗氧化功效[24]。5種發酵方式制得的銀杏粉中酚類物質分別檢出0、2、1、0、3種，相對含量均很低，但因其閾值低，對整體風味仍具有一定的影響。R組和R+J組中酚類物質相對含量分別為2.37%和1.58%，M+R+J組中酚類物質相對含量為3.95%，含量最高，其中丁香酚是特有成分，占全部酚類物質的比例高達40%，丁香酚具有典型丁香香氣，且閾值很低[25]。

適量的酸味可賦予食品舒適、柔和的口味，既能增進食欲，又能使腸胃內的纖維素、鈣等物質迅速溶解[26]。5種發酵方式制得的發酵銀杏粉中的酸味物質含量差異較大，M+R+J組中檢測到8種酸味物質，相對含量最高達13.46%，賦予了銀杏粉柔和舒適的酸味；M+R、R+J、M、R組分別檢測到2、1、2、1種酸類物質，相對含量分別為1.58%、2.38%、1.58%、0.79%，這些產品的酸味不突出，對整體風味幾乎沒有貢獻。

揮發性酯類物質對食品風味的貢獻較大，賦予產品令人愉悅的果香和酒香[27]。5種發酵方式中，只有M+R和M+R+J兩組檢測出揮發性酯類物質，分別檢出1、6種，相對含量分別為8.7%和11.87%。癸酸乙酯和辛酸乙脂是M+R+J組中的代表性成分，這兩種物質均是世界著名的法國白蘭地酒如馬爹利、人頭馬等中的特征風味組分[28]。

3 結論

不同發酵方法對產品中黃酮、多酚、可溶性蛋白、可溶性糖、總抗氧化能力影響明顯。M+R+J組的黃酮類物質、多酚、總抗氧化能力均最高，且顯著高于其他4組(P<0.05)。可溶性蛋白含量最高，可溶性糖含量顯著高于R組和R+J組(P<0.05)。5組發酵產品中揮發性風味成分種類和相對含量差異明顯。M+R+J組中檢測到的醇類物質、酚類物質、酸味物質、揮發性酯類物質的相對含量均最高，這些物質賦予了產品酸香適宜、風味濃郁的風味；檢測到的醛類物質相對含量最低，聞不到刺激性氣味；檢測到的烴類物質相對含量雖然不是最高，但由于5組中的烴類物質大多數為飽和脂肪烴類，嗅覺閾較高，對產品的風味影響較小。酶解后采用乳酸菌協同酵母菌發酵有利于發酵銀杏粉中營養成分的析出和風味物質的富集，是最佳的發酵方法，可為銀杏果仁的進一步開發利用提供技術支撐。