Meprin A、IL-1β與靜脈丙種球蛋白無效型川崎病的關聯性研究

陳錚潔，吳 菱，胡芳芳，應倩倩，狄亞珍，鐘世玲

(1. 寧波大學醫學院，浙江 寧波 315000；2. 寧波市婦女兒童醫院 小兒風濕免疫科, 浙江 寧波 315000；3.寧波市第一醫院 小兒風濕免疫科，浙江 寧波 315000)

川崎病(kawasaki disease, KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是主要累及中小型動脈的全身性血管炎，已經取代了風濕熱成為兒童獲得性心臟病的主要病因[1]。靜脈丙種球蛋白(IVIG)是目前大家公認的治療KD的一線藥物，可將動脈瘤的風險從25%～30%，降至5%～7%[2]。據近期統計，IVIG-無效型KD的發生率呈上升趨勢，并呈現出冠狀動脈損害(coronary artery lesions, CAL)高風險[3]。KD患兒首次IVIG- 治療效果欠佳, 是 KD 急性期治療難點之一。目前KD丙種球蛋白抵抗的機制尚不明確，研究表明可能與遺傳因素、炎性介質的作用(如IL-1β、IL-6等)及T淋巴細胞活化等相關[4-5]。金屬蛋白酶Meprin A是炎癥過程中重要的蛋白水解調節劑，可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉變為有生物活性的IL-1β，引起炎癥及組織損傷[6]。國外研究發現在冠狀動脈炎小鼠模型的血清中發現Meprin A的水平顯著升高[7]。因此, 本研究通過比較血清Meprin A、 IL-1β在KD丙種球蛋白使用前后的變化，旨在探討Meprin A、 IL-1β在IVIG-無效型KD中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2016年12月至2019年3月在我院確診的接受IVIG-標準化治療KD患兒410例為試驗組，納入標準：診斷明確且資料完整的KD患兒，診斷標準參考AHA2017[8]。排除標準：合并有其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等。另外選取我院同期住院的上呼吸道感染的患兒201例作為對照組，排除自身免疫性疾病、其他感染性疾病、腫瘤等。兩組患兒2周內均未給予激素、免疫抑制劑、IVIG治療。所有試驗組患兒均進行IVIG及阿司匹林治療，根據IVIG治療效果(首劑IVIG-治療36 h，仍持續發熱(>38 ℃)，或給藥后熱退2～7 天甚至2周再發熱，且至少具備l項KD主要表現者，定義為IVIG-無反應)分為IVIG-有效組(355例)和IVIG-無效組(55例)。本研究患兒的家屬均簽署知情同意書及獲得醫院醫學倫理委員會批準，批準號【2018】倫審字(22)。

1.2檢查項目 記錄患兒的年齡、性別、臨床特征以及首劑應用IVIG時間、熱程等，同時記錄實驗室數據包括白細胞計數(WBC)，血紅蛋白(Hb)，血小板計數(PLT)，C反應蛋白(CRP)，紅細胞沉降率(ESR)，丙氨酸轉氨酶(ALT)，白蛋白(ALB)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、NT-proBNP等。所有KD患兒入院時及隨訪8周內檢測心臟彩色超聲共3～4次。根據心臟超聲提示：冠狀動脈擴張或冠狀動脈瘤，定義為冠狀動脈損害(CAL)。

血清Meprin A、IL-1β檢測：所有入組KD患兒在急性期(病程3～7 d)和緩復期(體溫正常癥狀消失，病程2～3周)分別采取空腹靜脈血4 ml，以3 000 r/min速率，離心10 min，分離出血清，保存于-80 ℃冰箱中待檢。對照組患兒入院采集空腹靜脈血2 ml，處理方法與KD組相同。取上述血清，分別使用Meprin A ELISA試劑盒及IL-1β ELISA試劑盒(分別購于BD公司)通過酶聯免疫吸附法檢測Meprin A及IL-1β水平。

1.3治療方法 對KD患兒均提供IVIG治療，IVIG-有效組及IVIG-無效組均采用同一公司生產的IVIG(成都蓉生藥業有限公司，國藥準字S19993042，50 ml：2.5 g/瓶)，同時服用阿司匹林腸溶片(辰欣藥業股份有限公司，國藥準字H37023270，25 mg/片)：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。IVIG-無效組：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，無效再次予IVIG- 2 g/kg或激素2 mg/kg或IVIG- 2 g/kg加激素2 mg/kg，阿司匹林減量1/3～1/2，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。

2 結 果

2.1KD組與對照組臨床與實驗室特點 410例KD患兒，男性226(55.1%)，中位年齡2歲，最小3月，最大10歲；對照組201例，男性108(53.7%)，中位年齡1.5歲，最小6月，最大10歲，兩組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。KD患兒急性期WBC、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2KD急性期與緩解期實驗室指標變化 KD患兒急性期WBC、Hb、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于緩解期(P<0.01)，見表2。

表1 KD組與對照組臨床特征及實驗室指標比較

表2 KD急性期與緩解期實驗室指標比較(n=410)

2.3IVIG-有效組與無效組臨床和實驗室特點 410例KD患兒中IVIG-有效組355例(86.6%)，男性193例(54.4%)，中位年齡2.4歲；IVIG-無效型型有55例(13.4%)，男性33例(60.0%)，中位年齡2.4歲，兩者之間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。與IVIG-有效組比較，IVIG-無效組首劑應用IVIG時間、熱程較長，皮疹及結膜充血發生率較高，冠狀動脈損害率更高(61.8%)(P<0.01)；IVIG-無效組血清IL-1β、Meprin A水平均顯著高于IVIG-有效組(P<0.01)； IVIG-無效組及IVIG-有效組兩組間WBC、CRP、ESR、NT-proBNP及MEP比較差異有統計學意義(P<0.01)，而Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 IVIG-有效組與IVIG-無效組臨床特征及實驗室指標比較

2.4單因素進行ROC分析 在6項實驗室指標中，血Meprin A曲線下面積最大(0.911)，其次是NT-proBNP(0.831)及IL-1β(0.823)，見圖1。有統計學意義的臨床指標及實驗室指標對IVIG-無效型KD的診斷評價：NT-proBNP≥985.5 ng/L，預測IVIG-無效型KD的敏感性為74.5%，特異性為73.0%；Meprin A≥12.95 ng/ml，預測IVIG-無效型KD的敏感性為81.8%，特異性為89.6%；血清IL-1β≥4.05 pg/ml預測IVIG-無效型KD的敏感性為61.8%, 特異性為87.3%；當同時滿足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/ml時，預測IVIG-無效型KD的敏感性60%，特異性94.9%。見表4。

圖1 6項指標ROC曲線

表4 臨床指標(熱程、IVIG應用時間)及實驗室指標對IVIG無效型KD的診斷效能

2.5Meprin A與其他實驗室指標的相關性分析 Spearman相關性分析發現Meprin A與IL-1β及NT-proBNP存在顯著的相關(r=0.635，P<0.01；r=0.785，P<0.01), 與WBC、CRP、ESR有一定的相關(r=0.341，P<0.01；r=0.374，P<0.01；r=0.373，P<0.01), 而與Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C無相關性，見表5。

表5 Meprin A與其他實驗室指標的相關性分析

3 討 論

KD是一種主要發生于兒童的非特異性全身血管炎性疾病，好發于5歲以下嬰幼兒，已成為兒童后天獲得性心臟病的原因之一。IVIG是KD的標準治療方法，可有效的縮短發熱時間，減少全身炎癥反應，減少冠狀動脈病變的發生[9]。但研究表明，有5%～38.3%的KD患者可出現IVIG-無反應，且CAL作為KD 最常見且最嚴重的并發癥，可能與IVIG-耐藥有關[3]。本研究中IVIG無效型的發生率為13.4%，其中IVIG-無效組冠狀動脈損害率高達61.8%。與IVIG-有效組比較，IVIG-無效組的CAL患病率增加了近5倍。IVIG-無效型KD冠狀動脈損害的高風險，可能與IVIG-無反應KD炎癥誘導更嚴重相關，但仍待進一步研究。

IVIG-無效型KD的發病機制尚不明確。目前認為IL-1β在KD的發病機制中起重要作用[10]，抑制IL-1β途徑以及阻斷IL-1β信號傳導可以抑制KD的發生發展[11]。本研究證實KD患兒急性期血清IL-1β水平明顯高于對照組及緩解期(P<0.05)，且與代表KD疾病活動性的實驗室指標ESR、CRP、WBC正相關，或可作為評估疾病活動性的有效指標。同時還發現IVIG-無效組患兒血清IL-1β水平明顯高于IVIG-有效組(P<0.05)。這提示IL-1β的水平可能決定對IVIG-的反應[4]。本研究再進一步發現當血清IL-1β≥4.05 pg/ml時預測IVIG無效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測IL-1β可作為IVIG無效型KD的預測指標之一。

在體外實驗及死亡KD患兒的尸檢中均發現冠狀動脈炎中存在CD8+T細胞浸潤[12-13]。同時研究還表明CD8+T淋巴細胞高度活化可能會引起IVIG的耐藥[14-15]，可見CD8+T細胞過度激活及其活化在IVIG-無效型KD發病及冠狀動脈損害的機制中發揮了重要作用。有研究提示IL-1β負責抗原驅動的CD8+ T細胞的分化，增殖，記憶以及向包括冠狀動脈壁在內的組織遷移[16-17]。因此，我們認為IL-1β可能通過介導CD8+T淋巴細胞活化的失衡及向冠狀動脈的遷移，參與IVIG-無效型KD的發生及其冠狀動脈損害。

本研究還發現KD患兒血清Meprin A水平明顯高于對照組(P<0.01)。內脂酶Meprins是一種含鋅金屬肽酶，包含α及β兩個亞單位，由不同的基因編碼。Meprin A是α亞基(α-α)的同二聚物或α和β亞基的異二聚體(α-β)[18-19]。Meprins具有水解內源性生長因子、血管活性肽、細胞因子和細胞外基質的功能[6]。研究表明，Meprin A在冠狀動脈粥樣硬化及冠心病等心血管疾病患者外周血中表達增加[20]。Kentsis等[7]發現在KD患者急性期血清中及KD伴冠狀動脈病變小鼠模型的冠狀動脈組織中同樣存在Meprin A水平升高，與本研究保持一致。同時通過對比KD患兒急性期及緩解期血清Meprin A水平，我們發現急性期血清中Meprin A表達明顯升高，并與KD疾病活動性相關的實驗室指標ESR、CRP、WBC呈正相關。且IVIG-無效組外周血循環中Meprin A的水平亦明顯高于IVIG-有效組(P<0.001)。當血清Meprin A≥12.95 ng/L時預測IVIG-無效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測Meprin A不僅可作為KD患兒疾病活動性的指標之一，同時還可預測IVIG-無效型KD。

已有研究表明Meprin-A可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉變為有生物活性的IL-1β，同時除了水解IL-6使其失活外，又可通過裂解細胞膜上的IL-6R產生sIL-6R介導IL-6反信號傳遞，促進炎癥的發生發展[6]。IL-1β及IL-6高水平表達于在KD患兒外周血循環中，可能是KD致病及IVIG-無反應的重要炎性細胞因子。本研究發現Meprin A和IL-1β之間存在顯著相關(r=0.635，P<0.01)。且當同時滿足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/m時，預測IVIG-無效型KD特異性可高達94.9%。故推測Meprin A可能通過調節炎癥介質如IL-6途徑的失衡及IL-1β的進一步釋放，參與IVIG-無效型KD的發生及發展。

綜上所述，Meprin A、IL-1β可能參與KD的致病過程，不僅可作為KD疾病活動性的良好指標，且可較好預測IVIG-無效型KD。當然我們仍需要進一步擴大樣量，建立組織細胞水平，分子水平實驗，進一步深入探討Meprin A、IL-1β在IVIG-無效型KD中的發病機制，以期能指導臨床。