微藻超低溫保存條件的優(yōu)化研究

盧杰 閆洪波 范利偉

摘 ? 要：試驗(yàn)以小球藻為材料，探討不同處理?xiàng)l件對(duì)超低溫冷凍后成活效果的影響，以獲得最優(yōu)保存方法，重點(diǎn)針對(duì)微藻時(shí)期、預(yù)處理中的蔗糖濃度、玻璃化液中DMSO的濃度等方面的影響展開試驗(yàn)。結(jié)果表明，小球藻群體密度中等（OD680為0.800～1.100）的小球藻，0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的預(yù)處理液，30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亞砜+BG-11液體培養(yǎng)基的玻璃化液處理可以達(dá)到最高成活率，從而確定了小球藻的最適超低溫保存條件。

關(guān)鍵詞：微藻;超低溫保存;玻璃化液;研究

常用的藻種保藏方法多為在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，但此方法具有易污染、保藏時(shí)間短、操作煩瑣費(fèi)力和工作量大等缺點(diǎn)，而且多次傳代培養(yǎng)還易造成藻種退化。自從英國(guó)科學(xué)家C.Polge等學(xué)者在1949年首次用甘油作冷凍保護(hù)劑，并用超低溫冷凍保存的方法將動(dòng)物精子保存成功后，超低溫冷凍保存方法開始廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物的種質(zhì)保存[1]。由于超低溫冷凍保存法具有快捷、細(xì)胞成活率高并且所需設(shè)備簡(jiǎn)便、投資少等特點(diǎn)， 目前已在部分動(dòng)物和高等植物中進(jìn)行了深入研究，針對(duì)國(guó)內(nèi)藻類的超低溫冷凍保存的報(bào)道較少，試驗(yàn)以來源于石家莊辛集的微藻（Chlorella sorokiniana）為材料研究冷凍保存中的關(guān)鍵因素，建立了與之相適應(yīng)的超低溫保存體系。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

微藻藻種Chlorella sorokiniana（Shihira & R.W.Krauss）來源于石家莊市廢水。

1.2 ? 微藻超低溫保存處理方法

（1）在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為4 000 lx的培養(yǎng)箱中使用BG-11培養(yǎng)基在三角瓶中進(jìn)行微藻培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)，保證微藻正常生長(zhǎng)。

（2）通過用分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定微藻溶液的吸光度來確定微藻的生長(zhǎng)程度，選取不同生長(zhǎng)程度的微藻進(jìn)行同樣的超低溫處理，研究微藻生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)超低溫處理效果的影響。

（3）用12 000轉(zhuǎn)離心后收集微藻細(xì)胞，微藻細(xì)胞用含有0.5 mol/L甘油和不同濃度蔗糖的預(yù)處理液，于室溫下處理微藻20 min。

（4）預(yù)處理后離心收集微藻細(xì)胞，置于4 ℃冰箱中預(yù)冷的含有不同DMSO濃度的玻璃化液（30%蔗糖+15%乙二醇+不同濃度DMSO+BG-11液體培養(yǎng)液），并進(jìn)行脫水處理，1 h后在冰上更換新鮮的預(yù)冷玻璃化液，然后用紗布把EP管包住、用棉繩纏住快速放入液氮中，處理時(shí)間為90 min。

⑸液氮冷凍處理結(jié)束后，采取40 ℃恒溫水浴快速解凍法解凍。離心收集微藻細(xì)胞后，先加入0.4 mo1/L的蔗糖溶液在室溫平衡5 min，洗滌，棄上清，接著再加入1.2 mo1/L的蔗糖溶液于室溫平衡5 min[2]，進(jìn)行第2次洗滌，最后轉(zhuǎn)入BG-11液體培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測(cè)定成活率。

⑹參照 Canavat及Lubian[3]方法，用分光光度計(jì)于波680 nm處測(cè)藻液的吸光度，與之對(duì)照的百分比值即為經(jīng)過超低溫冷凍保存后的藻細(xì)胞成活率[4]。

上述試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣品，最終取其平均值。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同生長(zhǎng)時(shí)期的微藻對(duì)成活率的影響

由表1得知不同生長(zhǎng)時(shí)期的微藻對(duì)成活率的影響為：隨著微藻細(xì)胞濃度增大，冷凍處理后其成活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)680 nm吸光度值從0.649升高到0.982之間，成活率逐漸升高，并且在0.879～0.982之時(shí)成活率相差不是很大，達(dá)到了55%以上，但是在細(xì)胞濃度進(jìn)一步升高超過0.982之后其成活率逐漸降低，成活率最低僅有19.33%。王起華等人認(rèn)為抗凍性和藻類細(xì)胞年齡對(duì)成活率的影響與藻類種類有關(guān)[5]，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一個(gè)判斷。Piasecki等人在[6]研究細(xì)胞密度對(duì)衣藻冷凍成活率的影響時(shí)得到的成活率趨勢(shì)跟本試驗(yàn)完全一致。相對(duì)來說選擇OD680在0.800～1.100時(shí)成活率較高。

2.2 ? 預(yù)處理液中不同蔗糖濃度對(duì)成活率的影響

如圖1所示，沒有經(jīng)過高糖培養(yǎng)基預(yù)處理的藻細(xì)胞成活率較低，僅為32.37%，隨著蔗糖濃度的升高成活率逐漸升高，蔗糖濃度在0.4 mol/L時(shí)成活率最高。蔗糖濃度在0.5 mol/L以上時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高微藻成活率呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到0.9 mol/ L時(shí)，成活率僅19.14% ，這是由于過高的蔗糖濃度形成滲透脅迫對(duì)藻細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致藻細(xì)胞受損，影響其成活率，因此以0.5 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的組合最佳，成活率可達(dá)到58.35%。在冷凍前對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理能增強(qiáng)細(xì)胞的抗凍能力，常用的預(yù)處理液主要包括高濃度的蔗糖，有些研究中還在高濃度的蔗糖中加入甘油等其他保護(hù)劑[7，8]。與試驗(yàn)結(jié)果一致，表明合適的蔗糖濃度可以提高成活率。

2.3 ? 玻璃化液中不同DMSO濃度對(duì)成活率的影響

B.J.Finkle等認(rèn)為，DMSO、甘油、PEG是超低溫保存植物材料的常用保護(hù)劑，且三者混合使用效果更好[9]。但是防凍劑本身對(duì)微藻也有一定的毒性，隨著濃度的變化，毒性效果和保護(hù)效果也會(huì)有所變化。閆立強(qiáng)等[10]發(fā)現(xiàn)，DMSO對(duì)兩種藍(lán)藻的毒性與DMSO濃度有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，5%二甲基亞砜處理的微藻成活率最高。由此得知，高濃度的DMSO對(duì)微藻的毒害作用很大，但是低濃度的DMSO可以作為微藻的超低溫冷凍保護(hù)劑，同時(shí)低濃度的玻璃化液起到了一定的保護(hù)作用，而且對(duì)藻的毒性也小。

綜上所述，小球藻的生長(zhǎng)時(shí)期、預(yù)處理液中不同的蔗糖濃度，以及玻璃化液中不同DMSO濃度都對(duì)小球藻的超低溫冷凍成活率有著明顯的影響。選用藻時(shí)，既要求達(dá)到一定的密度，也要求其生長(zhǎng)活性較好，當(dāng)680 nm吸光值為0.854時(shí)，用含有0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的預(yù)處理液，及30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亞砜+BG-11液體培養(yǎng)基的玻璃化液連續(xù)處理后，其超低溫處理效果最好，從而確定這個(gè)條件是最好的小球藻超低溫保存條件。