超聲-酶提取毛麝香工藝優化及抗氧化活性研究

王呈文 蔡映舉 范佳偉

摘要 [目的]優化毛麝香全草的超聲-酶輔助法提取工藝，并評價其抗氧化活性。[方法]采用正交試驗優選最佳工藝。運用 DPPH法、ABTS法、NADH - PMS - NBT反應體系法和FRAP法測定總抗氧化能力4種體外抗氧化活性檢測方法，并以VC為陽性對照，對比研究毛麝香4種不同提取物的抗氧化活性。[結果]最優工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、纖維素酶用量0.6%，此條件下的提取率為3.48%。毛麝香乙酸乙酯相的抗氧化能力最佳，對清除3種自由基（DPPH·、ABTS+·、O2·-）的IC50分別為126、156和512 μL，總抗氧化能力測定值為16.7 mg/g。[結論]該提取方法簡便、可行，提取物具有良好的抗氧化能力。

關鍵詞 毛麝香;超聲-酶輔助;工藝優化;抗氧化

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the ultrasonicenzymeassisted extraction process of Adenosma glutinosum and evaluate its antioxidant activity. [Method]The best process was preferred using orthogonal test.Four methods of in vitro antioxidant activity detection by DPPH method， ABTS method， NADHPMSNBT reaction system method and FRAP method were used， and VC was used as a positive control. The antioxidant activities of four different extracts of Adenosma glutinosum were compared. [Result]The optimal process conditions were obtained as follow： ethanol concentration of 75%， solidliquid ratio of 1∶40 （g∶mL）， ultrasonic temperature of 60 ℃， ultrasonic time of 30 min and cellulase dosage of 0.6%. The extraction rate of this condition was 3.48%. The ethyl acetate fraction of Adenosma glutinosum had the strongest antioxidant capacity. The IC50 of ethyl acetate fraction for removing three kinds of free radicals （DPPH·， ABTS+·，O2·-） was 126， 156 and 512 μL， respectively， and the total antioxidant capacity was 16.7 mg/g.[Conclusion]The extraction method is simple and feasible， and the extract exhibited strong antioxidant activity.

Key words Adenosma glutinosum; Ultrasonicenzymeassisted; Process optimization; Antioxidant activity

毛麝香[Adenosma glutinosum（L.）Druce]為玄參科毛麝香屬植物，屬直立本草，別名麝香草、涼草、五涼草、酒子草、毛老虎、餅草、香草（廣西）等，分布在我國南部，是一種藥用性較強的適應性野生藥用植物，具有殺菌、消炎、祛風止痛、散瘀消腫、解毒止癢等功效。有學者對毛麝香進行了揮發油化學成分的研究及乙醇提取物化學成分的研究，并分離得到23個化合物。

目前對毛麝香的基礎性研究還不夠深入和全面，產業化發展程度較低，主要集中為種植及普通的干草藥物銷售上，而一些高附加值的深加工產品目前尚未開發，沒有充分發掘其價值[1-6]。

超聲-酶輔助提取法是一種較新的提取技術，快速方便可行。超聲提取的主要理論依據是超聲的空化效應、熱效應和機械作用。當大能量的超聲波作用于介質時，介質被撕裂成許多小空穴，這些小空穴瞬時閉合，并產生高達幾千個大氣壓的瞬間壓力，即空化現象。超聲空化中微小氣泡的爆裂會產生極大的壓力，使植物細胞壁及整個生物體的破裂在瞬間完成，縮短了破碎時間，同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放、擴散和溶解，從而顯著提高提取效率。纖維素酶能夠破壞細胞壁，增加溶劑穿透力，高效快速提取細胞內物質，提高了傳質速率，對提取物的結構和活性不產生影響，從而提高提取率和縮短提取時間。

目前，對于毛麝香的超聲-酶輔助法提取工藝及其抗氧化活性的系統研究鮮見相關報道。該試驗通過設計5因素5水平正交試驗，對毛麝香的超聲-酶輔助法提取工藝進行優化，并進行4種不同自由基的系列抗氧化活性的測試，為進一步科學合理地利用和開發毛麝香的藥用價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材

毛麝香，采購自廣東汕頭藥材市場，產地為廣東潮汕地區;DPPH·、纖維素酶（400 U/mg），福州飛凈生物科技有限公司;ABTS+·、NBT、PMS、NADH、VC標準品，上海如吉生物科技發展有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法），上海碧云天生物技術有限公司;其余試劑均為國藥或西隴的分析純。

1.2 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;DNM-9602自動酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司;超聲波清洗器，昆侖市超聲儀器有限公司;真空冷凍干燥器，杭州聚同電子有限公司;萬分之一電子分析天平，賽多利斯（Sartorius）科學儀器（北京）有限公司;大龍移液槍及槍頭;其余儀器均為實驗室常用試驗分析儀器。

1.3 方法

1.3.1 超聲-酶輔助法提取毛麝香工藝優化。

1.3.1.1 樣品溶液的配制。稱取1 g粉粹好的毛麝香，采用超聲協同纖維素酶輔助提取法對毛麝香抗氧化活性物質進行提取，提取后，用高速離心機分離，取上清液，再使用0.45 μm 微孔濾膜再次過濾，用容量瓶定容至50 mL，待測[7-12]。

1.3.1.2 DPPH·的清除試驗。用無水乙醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液，現配現用并避光[11-15]。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液6 mL，往其中加0.5 mL樣品溶液，混合，避光暗處靜置30 min后，519 nm處測吸光度A待測樣。

取6 mL的無水乙醇，往其中加0.5 mL樣品溶液，混合，519 nm處測吸光度A待測樣空白對照。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液6 mL，再加0.5 mL的無水乙醇，混合，避光暗處靜置30 min后，519 nm處測吸光度ADPPH·空白對照。

按照公式（1）計算各樣品溶液的DPPH·清除率，試驗重復3次，取平均值。

DPPH·清除率= 1 -（A待測樣 - A待測樣空白對照） ADPPH·空白對照×100%（1）

1.3.1.3 正交試驗。參考文獻并通過預試驗，得出乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時間（D）、纖維素酶用量（E）是影響毛麝香提取物抗氧化活性的主要因素，故設計5因素5水平用正交表L25（56）安排試驗，以DPPH·的清除率為評價指標，篩選最佳提取工藝。

1.3.2 毛麝香提取物的抗氧化活性研究。

1.3.2.1 毛麝香提取物的制備。將毛麝香全草自然晾干，用粉碎機粉碎成粉末，稱取毛麝香粉末質量1 kg，按照正交試驗的最佳提取工藝條件進行提取，重復3次，合并提取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮得到粗提物浸膏，將部分粗提物浸膏真空冷凍干燥至恒重，待用;另一部分粗提物浸膏用超純水重新分散溶解，依次用體積比為1∶1的石油醚、乙酸乙酯各萃取5次，分別減壓濃縮得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏和剩余水相浸膏，真空冷凍干燥至恒重，各凍干物冷藏保存待用。

1.3.2.2 樣品液的配制。分別準確稱取0.010 0 g毛麝香乙醇粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相和剩余水相凍干物，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的樣品液，待測。

1.3.2.3 DPPH·清除能力測定。用無水乙醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液，現配現用并避光[11-14]。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液 4 mL，往其中準確加入x μL不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據預試結果設用量梯度），再準確加入（2 000-x）μL的無水乙醇，混合，避光暗處靜置30 min后，519 nm處測吸光度A待測樣。

準確加入x μL不同體積的1 mg/mL樣品液（根據預試結果設梯度），再加（6 000-x）μL的無水乙醇，混合，519 nm處測吸光度A待測樣空白對照。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液 4 mL，再加2 mL的無水乙醇，混合，避光暗處靜置30 min后，519 nm處測吸光度ADPPH· 空白對照。另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據預試結果設用量梯度）作為陽性對照。按照公式（1）計算各溶液的DPPH·清除率，試驗重復3次，取平均值。

1.3.2.4 ABTS+·清除能力測定。用超純水配制2.45 mmol/L 過硫酸鉀和7 mmol/L ABTS+·混合溶液，避光并靜置16 h，配制成ABTS+·儲備液。臨用前用超純水稀釋至吸光度A734 nm=0.70±0.02 的ABTS+·測試液[11-14]。

取0.10 mmol/L 的ABTS+·測試液 4 mL，往其中準確加入x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據預試結果設用量梯度），再準確加入（2 000-x）μL 的無水乙醇，混合，避光暗處靜置6 min后，734 nm處測吸光度A待測樣。

準確加入 x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據預試結果設梯度），再加（2 000-x）μL 的無水乙醇、4 mL超純水，混合，734 nm處測吸光度A待測樣空白對照。

取0.10 mmol/L的ABTS+·測試液4 mL，再加2 mL的無水乙醇，混合，避光暗處靜置6 min 后，734 nm處測吸光度AABTS·空白對照。

另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據預試結果設用量梯度）作為陽性對照。按照公式（2）計算各溶液的ABTS+·清除率，試驗重復3次，取平均值。

ABTS+·清除率=[1 -（A待測樣 -A待測樣空白對照）/AABTS·空白對照]×100%（2）

1.3.2.5 O2·-清除能力測定。用超純水分別配制0.3 mmol/L的NBT磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）、0.936 mmol/L的NADH磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）和0.120 mmol/L的PMS磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）[14-15]。

依次分別加入1.5 mL的以上3種磷酸緩沖液，再往其中準確加入 x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據預試結果設用量梯度），再準確加入（1 500-x）μL 的無水乙醇，混合，避光暗處靜置5 min后，560 nm處測吸光度A待測樣。

準確加入x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據預試結果設梯度），再加（1 500-x）μL 的無水乙醇，4.5 mL超純水，混合，560 nm處測吸光度A待測樣空白對照。依次分別加入1.5 mL的以上3種磷酸緩沖液，再加1.5 mL的無水乙醇，混合，避光暗處靜置5 min后，560 nm處測吸光度AO2·- 空白對照。

另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據預試結果設用量梯度）作為陽性對照。按照公式（3）計算各溶液的O2·-清除率，試驗重復3次，取平均值。

O2·-清除率=1 -（A待測樣 - A待測樣空白對照）AO2·-空白對照×100%（3）

1.3.2.6 FRAP 法測定總抗氧化能力。用超純水分別配制10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L鹽酸溶液配制）、100 mmol/L醋酸緩沖液（pH=3.6）和20 mmol/L氯化鐵溶液，按10∶1∶1的比例進行混勻后得RFAP測試液，現配現用。 取3.9 mL RFAP測試液，加入0.1 mL 0.5 mg/mL的待測樣品溶液（濃度根據預試結果設置），充分混勻后，在37 ℃的恒溫水浴中反應10 min，于593 nm下測定吸光度，以無水乙醇為空白對照。結果表達為每1 g干重相當于Trolox還原力的相當量（mg Trolox equivalent antioxidant capacity/g dry weight，mg TEAC/g DW），試驗重復3次，取平均值[14-15]。

2 結果與分析

2.1 超聲-酶輔助法提取毛麝香正交試驗

由正交試驗的測定結果（表2）可以分析因素影響的次序，R值越大，影響越大，RA>RB>RC>RE>RD，即影響毛麝香提取物抗氧化活性的因素的主次順序為乙醇濃度（A）>料液比（B）>超聲溫度（C）>纖維素酶用量（E）>超聲時間（D）;同時分析k值，可得出最優組合為A3B5C5D2E4，即乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、纖維素酶用量0.6%，此最佳工藝條件的毛麝香乙醇粗提物的提取率為3.48%。

2.2 毛麝香提取物的抗氧化活性比較

試驗結果表明（表3），毛麝香乙醇粗提物及其不同極性組分均有一定的抗氧化能力，其中乙酸乙酯極性組對于清除3種自由基（DPPH·、ABTS+·、O2·-）的IC50 值分別為126、156和512 μL，總抗氧化能力測定值為16.7 mg/g，是4種不同提取物中抗氧化能力最強的組分，但抗氧化能力略低于陽性對照（VC）組。 其余3個提取物在4種抗氧化評價體系中也均表現出相同的變化趨勢，抗氧化活性強弱從大到小依次為乙酸乙酯相>乙醇粗提物>剩余水相>石油醚相。乙酸乙酯組分中多為中等極性的成分，其含有較豐富的具有良好抗氧化功效的多酚、黃酮類化合物。

2.3 重復性試驗

取5份試樣，按照最佳提取工藝進行提取，毛麝香乙醇粗提物的提取率分別為3.38%、3.42%、3.59%、3.48%、3.63%，并用其進行DPPH·清除能力測定，得到的IC50值分別為310、332、308、315、335。

3 結論

超聲-酶輔助提取法高效簡便，且提高了毛麝香有效成分的提取率，是一種較為理想的毛麝香抗氧化活性成分的提取方法。通過5因素5水平的正交試驗，得出影響毛麝香提取物抗氧化活性的因素的主次順序為乙醇濃度（A）>料液比（B）>超聲溫度（C）>纖維素酶用量（E）>超聲時間（D），以及最優工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、纖維素酶用量0.6%，此最佳工藝條件下毛麝香乙醇粗提物的提取率為3.48%，而沒有加入纖維素酶輔助提取的提取率僅為2.61%。

抗氧化活性試驗采用了4種抗氧化評價方法，較為系統客觀地對比分析了毛麝香乙醇粗提物及其不同極性組分（乙醇粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、剩余水相）的抗氧化活性，結果表明4種不同提取物均有一定的抗氧化能力，也均表現出相同的變化趨勢，抗氧化活性強弱從大到小依次為乙酸乙酯相>乙醇粗提物>剩余水相>石油醚相，其中乙酸乙酯相的抗氧化活性最佳，但抗氧化效果略低于陽性對照（VC）組。

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