牛奶中三聚氰胺檢測方法的研究進展

趙 丹

（安陽市畜產品質量安全監測檢驗中心，河南 安陽 455000）

三聚氰胺（Melamine），化學式C3N3（NH2）3，俗稱密胺、蛋白精，國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）命名為1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水（3.1 g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、吡啶等，不溶于丙酮、醚類，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。

蛋白質主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺的分子式含氮量約為66%。通用的蛋白質測定方式凱氏定氮法是通過測出含氮量來估算蛋白質含量，添加三聚氰胺能使生鮮乳中蛋白質含量偏高。使劣質食品通過檢驗機構的測試。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測試蛋白質含量增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發現。

從2007 年上半年中國食品出口質量危機、美國寵物食品污染事件到2008年下半年的中國問題嬰幼兒配方奶粉事件，人們始終把目光聚焦在飼料中人為添加三聚氰胺上。隨著政府監測商品范圍的擴大，逐漸發現即使動物食用未添加三聚氰胺的飼料時，牛奶、雞蛋中仍會出現三聚氰胺的少量殘留，主要原因就是畜禽養殖過程中大量使用了環丙氨嗪（殺蟲劑）。環丙氨嗪在動物和植物體內可通過脫烷基作用代謝為三聚氰胺，環丙氨嗪在土壤和環境中的主要物理化學降解方式是光降解，降解產物主要為三聚氰胺。

各個品牌奶粉中蛋白質含量為10%～20%，蛋白質中含氮量平均為16%。以某合格牛奶蛋白質含量為2.8%計算，含氮量為0.448%，某合格奶粉蛋白質含量為18%計算，含氮量為2.88%。而三聚氰胺含氮量為66.6%，是牛奶含氮量的約150 倍，是奶粉含氮量的約23 倍。每100 g 牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白質含量。

中國國家食品質量監督檢驗中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，故暫未設定像農藥殘留那樣的標準限制。2008年10月8日，衛生部、工業和信息化部、農業部、國家工商行政管理總局和國家質量監督檢驗檢疫總局聯合發布公告，制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值。2012年7月5日，聯合國負責制定食品安全標準的國際食品法典委員會（CAC）為牛奶中三聚氰胺含量設定了新標準，即液態牛奶中三聚氰胺含量不得超過0.15 mg/kg。CAC 曾在2010 年規定，用于制造奶粉的牛奶中三聚氰胺含量最多不得超過1 mg/kg，其他食品中，三聚氰胺含量不得超過2.5 mg/kg。三聚氰胺含量新標準將有助于各國政府更好地保護消費者權益和健康。該文綜述了原料乳和飼料中三聚氰胺檢測的樣品前處理技術和分析方法。

1 樣品前處理技術

因為原料乳中三聚氰胺的含量較低，因此樣品的前處理是分析工作中至關重要的一步。分析方法的檢出限、回收率和準確度都和樣品的萃取凈化分離程度密切相關。

樣品前處理包括三聚氰胺的提取、凈化和濃縮。提取是用適當的溶劑將三聚氰胺和樣品基質從固相樣品中轉移到易于凈化和分析的液態；凈化是指將三聚氰胺與提取液中的干擾基質分離。

液-液萃取是最常用的一種分離萃取技術。其樣品處理簡單，設備要求低。常用的提取劑有50%乙腈水溶液、甲醇、磷酸鹽緩沖溶液等。超聲波輔助萃取極大地提高了萃取分離效果。

固相萃取技術是目前常用的凈化手段。其原理與液相色譜相似，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與基體及干擾物質分離后，再用洗脫液將其洗脫，達到分離和富集的目的。三聚氰胺化學結構中含有3 個伯胺集團，在酸性條件下會形成正離子，因而可采用強陽離子固相萃取柱對樣品進行凈化。

因三氯乙酸有沉淀蛋白的作用，并且在酸性條件下有助于三聚氰胺的溶解，采用1%三氯乙酸作為提取劑，渦旋混勻，超聲提取，14 000 rpm/min 離心。取10 ml 上清液備用過（MCX）柱。取3 ml甲醇活化MCX柱→3 ml水平衡→取10 ml提取液過柱→3ml水、3ml甲醇淋洗→3 ml5%氨化甲醇洗脫→50 ℃空氣吹干→加入20%甲醇溶液1 ml復溶→過濾供上機分析。

前處理注意事項：①MCX 固相萃取柱或等效者，如PCX、SCX、TCX等。更換柱子時需做柱回收試驗，柱回收率90%以上方可使用。②凈化時控制過柱速度1ml/min(1滴/2～3 s），活化、平衡及淋洗時可適當加快，但絕對避免液體呈線性流出。③該實驗方法稱取樣品2 g，提取液體積V1為20 ml（牛奶2 g約2 ml+18 ml），凈化液體積V2為10 ml，定容體積V3為1 ml，相當于稱樣2 g，稀釋2倍。

2 分析方法

高效液相色譜法（HPLC）是目前應用比較廣泛的測定方法之一，較常用的色譜柱有C8、C18柱，檢測器有二極管陣列檢測器和紫外檢測器。因三聚氰胺中含有胺根，具有較強的極性，使其在傳統的反相鍵合相上保留很差，接近于死時間流出，不能進行分析。為了增加三聚氰胺在傳統色譜柱上的保留，必須選用洗脫能力非常弱的流動相，通常選用的流動相有水-乙腈、甲醇-水、醋酸銨緩沖溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇等。

由于三聚氰胺極易與C18 柱上殘余的硅醇基形成氫鍵，使峰型拖尾，因此經常將辛烷磺酸鈉，庚烷磺酸鈉等離子對試劑加入到流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對來改善峰型。我國農業行業標準NY/T1372-2007《飼料中三聚氰胺的測定》也采用了這一辦法。有關文獻報道在流動相中加入高氯酸可增加三聚氰胺的保留時間并改善峰型，還有采用依次連接兩根C18色譜柱的辦法，大大延長了分析物的保留時間。該實驗使用C8 柱，流動相中離子對試劑緩沖液為檸檬酸和庚烷磺酸鈉，流動相調試至色譜圖中三聚氰胺出峰位置無雜質干擾。該實驗操作最后使用的液相條件：流動相比例是10 mmol/L庚烷磺酸鈉、10 mmol/L檸檬酸溶液-乙腈（94∶6）；流速1.0 ml/min；柱溫30℃；檢測波長240 nm；進樣量20 ul。

限量值：嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值1 mg/kg；液態奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值2.5 mg/kg；含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值2.5 mg/kg，高于限量值的產品一律不得銷售。

3 展望

以上敘述的牛奶中三聚氰胺檢測方法是目前筆者所在實驗室正在用的檢測方法，缺點是提取過程不好把握，重現性不好，對于這個檢測方法在以后的工作實驗中會逐步探索，逐步改進。HPLC法是目前原料乳檢測三聚氰胺的常用方法，隨著科學技術的發展，分析方法的更新日新月異，簡單、快速、高效的檢測方法將是眾望所歸。

食品檢測中對三聚氰胺的檢測關系到人們的身心健康，人們對其分析方法有更多的期待。檢測準確、檢測限小、重現性好；技術產品或設備成本較低，運行費用低；適合現場快速檢測，是目前對三聚氰胺檢測方法的期待，也是將來三聚氰胺檢測的研究方向。