呼吸道合胞病毒感染致毛細支氣管炎患兒血清TLR4、TGF-β1水平變化觀察

何月賢，宋文秀，張麗梅，謝炳龍

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院，廣東珠海 519100

呼吸道合胞病毒(RSV)是導致毛細支氣管炎最常見的病原體，RSV感染致毛細支氣管炎病情嚴重程度不等，輕者經抗感染及對癥治療后緩解，嚴重者可致肺氣腫、呼吸衰竭甚至危及患兒生命[1]。文獻[2]報道，超過1/3的患兒因治療不及時可繼發為支氣管哮喘、喘息等，給患兒及家庭帶來沉重負擔。早期診斷RSV感染致毛細支氣管炎并評估病情嚴重性，對臨床制定針對性治療方案具有重要意義，同時也為臨床預測喘息發病風險，并采取相關干預措施提供指導。RSV感染致毛細支氣管炎屬炎癥反應性疾病，炎癥細胞及其分泌的炎性細胞因子作用的炎癥反應貫穿整個發病過程[3,4]。Toll樣受體-4(TLR4)是由巨噬細胞、單核細胞等合成的跨膜受體蛋白，通過識別接頭蛋白介導了細胞信號轉導途徑而激活天然免疫反應。研究[5,6]發現，TLR4信號轉導通路還介導了病毒性心肌炎、哮喘等炎癥疾病的發病過程。轉化生長因子-β1(TGF-β1)廣泛存在于哺乳動物的骨組織細胞及轉化細胞中，介導了細胞增殖、分化、氧化應激、組織修復等生理過程，同時通過誘導炎性細胞因子的釋放而調節炎性免疫應答[7,8]。目前，關于TLR4、TGF-β1在RSV感染致毛細支氣管炎發病過程中與炎癥反應的關系研究較少。本研究通過檢測血清TLR4、TGF-β1，并探討其與RSV感染致毛細支氣管炎病情嚴重性的關系及對并發喘息的預測價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年6月～2017年6月遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院收治的RSV感染致毛細支氣管炎患兒121例(觀察組)，男63例，女58例；年齡1個月～4歲，平均(10.32±4.16)個月；病程1～3(1.75±0.38)d。納入標準：①患兒典型臨床癥狀如咳嗽、喘息癥狀、雙肺廣泛喘鳴音或濕啰音，結合影像學和實驗室檢查等綜合確診為毛細支氣管炎，并符合《諸福棠實用兒科學》(第8版)中的診斷標準[9]；②鼻咽部標本經PCR檢查證實為RSV陽性；③患兒發病至入院時間≤3 d；④納入研究前1個月未內服用過糖皮質激素、白三烯等可能影響本研究結果的藥物；⑤臨床資料完整，且發病后隨訪時間均超過2 a。排除標準：①心臟功能不全者以及肝腎功能障礙患兒；②急、慢性炎癥反應性疾病患兒；③免疫性疾病患兒；④肺部畸形、先天性喉軟骨發育不全等出生缺陷患兒；⑤其他類型病原體感染或者有多種病原體混合感染的患兒；⑥納入研究前1個月內有呼吸道感染史者；⑦惡性腫瘤患兒。參照《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識(2014年版)》分級方案[10]將觀察組患兒按照病情嚴重程度分級，其中輕度組59例，中度組38例，重度組24例。按照患兒發病后2年內是否繼發為喘息分為兩組，喘息組31例，非喘息組90例。另選50例同期健康體檢兒童作對照(對照組)，男27例，女23例；年齡20 d～5歲，平均(11.85±3.63)個月。兩組一般資料無統計學差異，具有可比性。本研究得到醫院倫理委員會的批準，研究對象家屬在知情同意書上簽字。

1.2 血清TLR4、TGF-β1檢測方法 收集觀察組患兒入院當日、健康體檢嬰幼兒體檢當日肘靜脈血3 mL，將血液標本于室溫下靜置1 h，以3 000 r/min的轉速離心5 min，離心半徑為12 cm，留取血清置于-70 ℃冰箱中，留待檢測。采用ELISA法檢測血清TLR4、TGF-β1，檢測儀器為芬蘭雷勃Thermo Multiskan FC全自動酶標儀，TLR4試劑盒由上海研吉生物科技有限公司提供，TGF-β1試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，操作過程嚴格按照試劑盒上說明進行。

2 結果

2.1 觀察組和對照組血清TLR4、TGF-β1水平比較 觀察組和對照組血清TLR4、TGF-β1水平比較見表1。

2.2 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較見表2。

表1 觀察組和對照組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與輕度組比較，*P<0.05，與中度組比較，#P<0.05。

2.3 觀察組血清TLR4、TGF-β1水平與病情嚴重程度的關系 觀察組血清TLR4與TGF-β1呈正相關(r=0.672，P<0.05)；血清TLR4、TGF-β1與病情嚴重程度呈正相關關系(rs=0.735、0.708，P均<0.05)。

2.4 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較見表3。

表3 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與非喘息組比較，*P<0.05。

2.5 血清TLR4、TGF-β1水平對RSV感染致毛細支氣管炎患兒繼發喘息的預測價值 血清TLR4水平預測RSV感染致毛細支氣管炎患兒繼發喘息的AUC為0.874(95%CI：0.819～0.9290)，約登指數0.69，最佳截斷值為28.49 ng/mL，靈敏度為0.79，特異度為0.85，準確性為0.82；TGF-β1的AUC為0.905(95%CI：0.859～0.952)，約登指數為0.73，最佳截斷值為30.76 ng/mL，靈敏度為0.82，特異度為0.88，準確性為0.86；TLR4聯合TGF-β1的AUC為0.925(95%CI：0.886～0.965)，約登陸指數為0.78,靈敏度為0.87，特異度為0.93，準確性為0.89(詳見圖1)。

3 討論

RSV為單鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒毛細支氣管炎最常見的病原體，由于嬰幼兒的免疫系統尚未發育完善，極易多次反復感染，損傷肺功能，且患兒繼發喘息風險遠高于普通兒童[11]。RSV感染致毛細支氣管炎病理改變包括毛細支氣管黏膜出現水腫且分泌量顯著增加，同時伴有上皮細胞脫落堵塞管腔，臨床癥狀主要有喘息、咳嗽、氣急以及低氧血癥等，患兒病情進展迅速，治療不及時可危及患兒生命[12,13]。早期診斷及治療RSV感染致毛細支氣管炎，并盡可能降低喘息發生風險是臨床關注的重點。

圖1 血清TLR4、TGF-β1預測RSV感染致毛細支氣管炎患兒繼發喘息的ROC曲線

研究[14]表明，免疫功能失調、炎性細胞及其分泌的炎癥因子等介導了RSV感染致毛細支氣管炎發病過程。TLRs是在天然免疫反應中發揮重要作用的受體家族，在識別不同的接頭蛋白后可介導信號途徑而參與不同的免疫反應，TLR4是屬于TLRs家族成員的I型跨膜蛋白，主要在細胞內或者細胞表面表達。研究[15]顯示，TLR4通過特異度識別病原體細胞外的亮氨酸重復序列而將信號傳導至細胞內發揮免疫應答反應，最終發揮抗病毒作用。劉冬云等[16]證實，TLR4表達上調通過與熱休克蛋白結合可增加細胞內鈣離子濃度，促進腫瘤壞死因子以及IL-6的合成，引起血管收縮和血壓升高，增加血管阻力損傷血管，同時還可促進血管平滑肌增殖，引起血管重構，損傷靶器官。馮等[17]發現，血紅素可使TLR4的MyD88/TRIF信號激活，進而促進炎癥反應發生。TGF-β1是廣泛存在于嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞、巨噬細胞等各種細胞中的促炎因子，通過介導免疫炎癥反應參與氣道疾病的發生發展過程[18]。研究[19]顯示，RSV感染后使無活性的TGF-β1激活并轉變成有活性TGF-β1，并進一步激活TGF-β1Ⅰ型及Ⅱ型受體，通過磷酸化作用激活依賴Smad信號通路并與CoSmad及Smad4結合，形成異源四聚體復合物進入到細胞核中，通過調控基因轉錄介導Th/Treg細胞所致的免疫反應。Wang等[20]認為，TGF-β1通過激活并趨化炎癥細胞因子而在喘息中發揮免疫炎癥反應。于永鵬[21]發現，TGF-β1通過介導氧化應激及炎癥反應導致神經元變性，進而參與帕金森病的發病過程。

本研究顯示，觀察組TLR4、TGF-β1水平高于對照組，并由此推斷TLR4、TGF-β1參與了RSV感染致毛細支氣管炎的發病過程，可能的機制是RSV感染后其包膜融合蛋白與宿主細胞融合并形成融合體，引起毛細支氣管分泌有活性的模式識別受體TLR4，進而介導天然免疫應答反應以增加呼吸道對入侵病原體的敏感性，以達到清除病原體的效果[22]；RSV感染毛細支氣管后，促使炎癥細胞釋放大量炎性細胞因子而發生炎癥反應，與此同時炎癥反應還促使內皮細胞、巨噬細胞等多種細胞釋放促炎因子TGF-β1，TGF-β1在依賴Smads蛋白的信號轉導及調控下，誘導Treg/Th17比例失衡，加重RSV感染致毛細支氣管炎。本文結果還顯示，隨著病情逐步加重，血清TLR4、TGF-β1逐漸升高，提示兩指標可反映RSV感染致毛細支氣管炎病情嚴重性，早期檢測可輔助臨床評估病情嚴重程度，從而指導臨床制定針對性干預方案改善患兒病情。而RSV感染致毛細支氣管炎患兒血清TLR4與TGF-β1呈正相關，提示兩指標可能通過協同作用促進病情發生及進展，但機制有待進一步探討。本研究還顯示，血清TLR4、TGF-β1與病程嚴重程度呈正相關，可能是因為TLR4與TGF-β1水平越高說明患兒免疫應答反應及炎癥反應越嚴重，病情也不斷加重。RSV感染致毛細支氣管炎患兒治療不及時可繼發為喘息，加重患兒病情，預后較差。本研究結果顯示，繼發喘息的患兒血清TLR4、TGF-β1水平更高，兩指標對繼發哮喘具有一定的預測價值，并且聯合檢測預測價值更高。提示患兒入院時盡快檢測血清TLR4和TGF-β1，可作為預測繼發喘息發生風險的生化指標。

總之，血清TLR4、TGF-β1表達上調通過介導免疫應答反應和炎癥反應而參與RSV感染致毛細支氣管炎發病過程，并與病情嚴重性密切相關，早期聯合檢測可作為預測患兒繼發喘息發生風險的潛在靶向指標，從而指導臨床實踐。