胃癌組織中PD-1、PD-L1表達變化及其意義

郭曉宇，米建強，米優嘉，左汪洋

1河南科技大學臨床醫學院，河南洛陽 471003；2河南科技大學第一附屬醫院

胃癌是最常見的消化系統腫瘤之一，國家癌癥中心發布的數據顯示胃癌的發病率在惡性腫瘤中排名第二，病死率中排名第三[1]。在我國，每年新發并確診的胃癌患者有41萬例，接受治療的胃癌患者5年生存率仍低于40%[2]，嚴重威脅人類的生命健康。目前，胃癌的診治仍以組織病檢及手術、放化療為主，雖然對早期胃癌的防治取得了較好的療效，但早期胃癌發病隱匿，有的發現時已是進展期胃癌。因此，尋求新的診斷及治療方案已經成為胃癌防治亟待解決的問題。近年來，針對程序性死亡因子-1(PD-1)及其配體(PD-L1)為靶點的免疫治療已部分應用于惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌等，其在胃腸道腫瘤中的應用，也正在不斷地進行著臨床試驗，并顯示了良好的應用效果，這為胃癌的診治及研究提供了新思路。本研究觀察了胃癌組織中PD-L1、PD-1表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2019年7月河南科技大學第一附屬醫院收治的胃癌患者102例(進展期胃癌76例、早期胃癌26例)，男77例，女25例；年齡35～80歲，中位年齡61歲；年齡≤60歲39例，>60歲63例；腫瘤直徑≤5 cm 32例，>5 cm 70例；分化程度高5例，中67例，低30例；浸潤深度在黏膜、黏膜下層26例，肌層、漿膜層76例；有淋巴結轉移67例，無淋巴結轉移35例。異型增生患者13例，男8例，女5例；年齡54～76歲。另選9例健康體檢者作對照，男5例，女4例；年齡52～81歲。手術切取進展期胃癌組織76例份(進展組)、早期胃癌組織26例份(早期)、異型增生組織13例份(增生組)及正常組織9例份(正常組)。

1.2 胃組織中PD-1、PD-L1檢測方法 所有標本均經4%中性甲醛固定24 h后制成組織蠟塊。切片機設置為3 μm，將組織蠟塊切制成3 μm厚的玻片，放置65 ℃烤箱1 h。PD-1的免疫組化染色步驟嚴格按照SP法試劑盒上的步驟進行操作，PD-L1的免疫組化染色應用SP法并結合脫蠟、水洗、EDTA熱修復、一抗孵育3 h、二抗孵育30 min、DAB染色等步驟進行。PD-1、PD-L1分別選扁桃體與胎盤進行免疫組化染色作為陽性對照，PBS代替一抗對組織進行免疫組化染色作為陰性對照。PD-1、PD-L1陽性結果的判定參照文獻[3,4]，陽性顯色是指細胞膜或細胞質中出現黃至棕褐色顆粒者，PD-1和PD-L1分子陽性表達率是結合染色強度和陽性細胞數百分比共同來評定的。染色強度分級：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞分級：在低倍顯微鏡下觀察整張切片，分別在腫瘤組織及腫瘤間質組織中隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞；PD-1的陽性細胞率(%)=陽性細胞數/觀察細胞數×100%，PD-L1的陽性細胞率(%)=陽性細胞數/觀察的全部腫瘤細胞數×100%[5,6]；陽性細胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分。陽性細胞分級評分與染色強度分級評分的乘積>3分為陽性表達。所有腫瘤標本的免疫組化切片均由2名資深病理科醫生雙盲獨立觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PD-1、PD-L1陽性率比較 進展組、早期組、增生組、正常組PD-1陽性率分別為55.3%、30.8%、30.8%、33.3%，PD-L1陽性率分別為46.1%、19.2%、7.7%、0，進展組與早期組、增生組、正常組比較，P均<0.05。

2.2 PD-1、PD-L1表達與胃癌臨床病理特征的關系 結果見表1，由表1可知，PD-1表達與胃癌的浸潤深度有關，PD-L1表達與胃癌患者發病年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤浸潤深度有關(P均<0.05)。

表1 PD-1、PD-L1表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中PD-1和PD-L1表達的相關性 胃癌組織中PD-1、PD-L1表達無相關性(P>0.05)。

3 討論

胃癌的發病率和病死率一直居高不下，其發病原因復雜多樣，與機體的自身免疫有著密切的關系。近年來，免疫治療在非小細胞肺癌中的研究及應用正如火如荼地進行著，為腫瘤的治療打開了一扇新的大門。PD-1即CD279，是細胞的穿膜受體之一，其胞外域與細胞毒T細胞相關抗原4(CTLA-4)、CD28和ICOS具有21%～33%的序列同源性。PD-1是由288個氨基酸排列而成的蛋白分子，主要表達于活化的B細胞、T細胞表面。PD-1有兩個配體，分別是PD-L1和PD-L2，PD-L1又稱為B7-H1，兩者基因均位于染色體9p24.1，有37%同源序列，可編碼產生Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1可表達在多種腫瘤細胞表面，PD-L2主要表達在抗原提呈細胞表面[7]。在免疫反應中，T細胞介導的免疫反應過程需要雙信號參與，第一信號是由抗原、T細胞受體三元復合體、主要組織相容性復合體組成的抗原識別信號；第二信號是以CD28為主所形成的共刺激信號。第一信號和第二信號均能激活T細胞，起到免疫防御的作用。PD-1作為細胞的穿膜受體之一，在免疫反應中參與調控T細胞的活化。PD-1/PD-L1的結合，可使T細胞胞質內發生磷酸化，結合蛋白酪氨酸磷酸化酶，形成SHP-2，SHP-2可通過抑制ZAP-70、P13K等分子，整體可以下調P13K-AKT-Mtor信號通路，從而抑制T細胞的活化。另外，PD-1與PD-L1結合可以通過增加轉錄因子BATF的表達，進一步對抗由TCR和CD28共同刺激產生的下游信號，抑制T細胞的功能[8]。

熊克宮等[9]搜集54例自身免疫性肝炎患者，其中活動期38例，緩解期16例，利用免疫組化的方法研究PD-1在自身免疫性肝炎患者中的表達，發現活動期的自身免疫性肝炎患者比緩解期患者PD-1的表達要高，證明了PD-1的高表達可作為機體免疫應激反應的指標之一。PD-L1在胃癌組織中的表達明顯高于正常及異型增生組，這為胃癌早期診斷及預測提供了理論依據。韋煒等[10]關于PD-1及PD-L1的研究表明，PD-L1在胃癌中的陽性表達率為40%～50%。不同研究者在類似實驗中PD-L1表達的陽性率的不同，一方面是因為試劑選擇的原因，抗體批號及生產廠家的不同，組織中表現的抗原表位也有所區別。另一方面，不同試劑在組織中表達的陽性評分標準有所不同，有的僅僅指的是著色的腫瘤細胞，由此產生的陽性表達率是有差異的[6]。PD-L1的陽性表達，與臨床的多種因素有關。PD-L1陽性者可以使調節性T細胞表達增高，抑制T細胞活性，預示著不良的預后[11]，但有學者提出，PD-L1陽性者可以使用免疫抑制劑進行腫瘤的治療，因此患者的生存期得以提高，反而預示著較好的預后[12,13]。在食管癌的研究中，Boger等[14]提出早期食管癌中PD-L1的陽性表達預示著較好的預后，可能是因為早期食管癌中PD-L1與體內某種未知免疫受體結合使T細胞增殖，分泌白介素、干擾素等細胞因子，而晚期食管癌主要是PD-1與PD-L1結合，誘導T細胞凋亡。由此，PD-L1的陽性表達，預示著不良的預后，若添加免疫抑制劑干預治療，可有望提高患者5年生存率。PD-1在非腫瘤性組織中的免疫組化染色中也有高表達[15]。張風賓等[16]統計82例患者術后5年生存率發現，PD-1、PD-L1高表達的患者術后生存期明顯比低表達的時間要短。PD-1及PD-L1在胃癌患者組織中的高表達，為胃癌進行免疫治療提供了病理方面的支持，并且有可能成為判斷生物學行為及評定疾病預后的有用指標。本研究顯示，PD-1、PD-L1隨著胃黏膜病變的進展，表達率逐漸升高，提示兩者可能在胃黏膜的癌變過程中充當一定角色，可作為胃黏膜發生癌變的監測指標；PD-1、PD-L1與胃癌的臨床病理特征有一定相關性，提示PD-1、PD-L1陽性表達的腫瘤具有更強的侵襲能力，PD-1、PD-L1陽性表達率明顯增高，預示著不良預后；PD-1、PD-L1在胃癌組織中有較高的表達率，陽性率分別為49.02%和39.22%，可做免疫治療的靶點，應用免疫抑制劑單藥或聯合治療。

總之，隨著胃黏膜病變的進展，PD-1、PD-L1表達率逐漸升高；檢測兩指標有助于胃黏膜發生癌變的監測，有望作為指導胃癌免疫治療及評估的指標之一。以PD-1和PD-L1為靶點的免疫抑制劑部分已經獲批并應用于非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤等多種惡性實體腫瘤，并取得了良好的療效[17]。目前，除了PD-1和PD-L1以外，還有LAG3、TIM3、CTLA-4等有關的靶點也逐漸引起研究者的關注，越來越多的免疫靶向藥物的單藥治療及聯合治療應用于臨床[18]。因此，檢測PD-1、PD-L1的表達有望作為指導胃癌免疫治療及評估的指標之一，為胃癌的治療帶來了新希望。