丹紅注射液靜注對大鼠腎病的治療作用及其可能機(jī)制

郭小云，李洪鈞，李榮

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211

腎病綜合征(NS)是因多種腎臟病理損害所致的嚴(yán)重蛋白尿及其引起的一組臨床表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為大量蛋白尿(≥3.5 g/d)、低白蛋白血癥(≤30 g/L)、高脂血癥和明顯水腫。一些NS的患者甚至可進(jìn)展至終末期腎病，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。生長分化因子(GDF-15)是TGF-β超家族成員之一[1]，人們發(fā)現(xiàn)在許多不同的病理?xiàng)l件下GDF-15在心臟和腎臟的表達(dá)上調(diào)[2]。近期研究[3]發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟病患者的GDF-15的表達(dá)與腎臟病進(jìn)展相關(guān)[4,5]，是獨(dú)立于包括尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)在內(nèi)的其他腎臟疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素[6]。丹紅注射液是一種中成藥，具有疏通脈絡(luò)，活血化瘀等效果。近期研究[7]發(fā)現(xiàn)，丹紅可以通過調(diào)節(jié)前列環(huán)素的合成，升高血漿一氧化氮水平，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。而多項(xiàng)臨床研究[8,9]也發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液可以顯著減少NS患者的尿蛋白。但是關(guān)于丹紅注射液能否延緩腎功能進(jìn)展、腎臟纖維化方面尚無相關(guān)研究。本研究觀察了丹紅注射液靜注對大鼠腎病的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑 丹紅注射液(山東步長制藥有限公司)；氯沙坦鉀(默沙東公司)。GDF-15 ELISA試劑盒(CSB-E16317r CUSABIO)；抗GDF-15多克隆抗體(bs-3818R)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；β-actin(Abbkine A01010，武漢艾美捷科技有限公司)；TRIzol(Invitrogen，批號15596026)；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(KR104)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)天根生化科技有限公司；尿蛋白定量測試盒(C035-2)、血尿素氮測試盒(C013-1)、血肌酐測試盒(C011-1)、血白蛋白測試盒(A028-1)、血甘油三酯測試盒(A110-2)、血總膽固醇測試盒(A111-2)來自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量110～130 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于天津市放射研究所，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(京)2016-0006。溫度控制在25 ℃左右、濕度控制在70%左右，環(huán)境為清潔級。32只大鼠隨機(jī)分為丹紅組、氯沙坦組、模型組、對照組各8只。

1.3 大鼠腎病模型制備及丹紅注射液應(yīng)用方法 丹紅組、氯沙坦組、模型組均一次性尾靜脈靜注6 mg/kg阿霉素制備腎病模型，對照組不制備模型；制模第4周，丹紅組靜注4 mL/(kg·d)的丹紅注射液，氯沙坦組灌胃給予12 mg/(kg·d)的氯沙坦，模型組和對照組灌胃給予12 mg/(kg·d)的生理鹽水，連續(xù)用藥4周。

1.4 尿液尿蛋白及血清白蛋白(Alb)、TG、TC、肌酐、尿素氮、GDF-15和腎組織腎小球硬化指數(shù)測算 各組大鼠分別于藥物治療第28天放入代謝籠中，留取24 h尿液，記錄尿量，離心后取上清液，采用CBB法檢測24 h尿蛋白定量。于第29天處死大鼠，處死前經(jīng)腹主動脈取血3 mL，采用全自動生化分析儀檢測血清白蛋白(Alb)、TG、TC、肌酐、尿素氮，另采用ELISA法檢測血清GDF-15，操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。處死大鼠，取腎組織約0.4 g，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。每組小鼠觀察100個(gè)腎小球，計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(%)。采用半定量分析法對腎小球硬化程度進(jìn)行分級，0級：所有腎小球均正常；1級：硬化區(qū)域<25%；2級：26%～50%；3級：51%～75%；4級：76%～100%。計(jì)算公式：腎小球硬化指數(shù)=[(1×n1)+(2×n2)+(3×n3)+(4×n4)]/(n0+n1+n2+n3+n4)，nx為不同硬化程度腎小球的數(shù)量。根據(jù)Raij等[10]半定量方法評估腎小球硬化程度。

1.5 腎組織GDF-15蛋白、mRNA檢測 GDF-15蛋白：采用Western blotting法。取處死大鼠腎臟組織0.1 g，冰上研磨腎皮質(zhì)，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，取上清，用考馬斯亮藍(lán)法檢測各細(xì)胞樣本蛋白含量，取30 μg蛋白，100 ℃加熱變性5 min，加至凝膠孔中，電泳，電轉(zhuǎn)至固相支持物上，然后分別用抗GDF-15多克隆抗體(1∶300)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶3 000)對其進(jìn)行孵育、檢測。用Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。GDF-15 mRNA：采用RT-PCR法。取處死大鼠腎臟組織0.1 g，用TRIzol提取腎組織樣本中總RNA。用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物對cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。正向和反向引物5′-GACCTAGGTTGGAGCGACTG-3′和5′-CCTGTGCATAAGAACCACCG-3′，mRNA表達(dá)量采用β-actin正向和反向引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′和5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC -3′矯正，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，×40個(gè)循環(huán)。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析，比較各組間表達(dá)的差異。

2 結(jié)果

2.1 各組尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和腎組織腎小球硬化指數(shù)比較 尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和腎組織腎小球硬化指數(shù)比較見表1。

表1 各組尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和腎組織腎小球硬化指數(shù)比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與氯沙坦組比較，cP<0.05。

2.2 各組血清GDF-15水平及腎組織GDF-15蛋白、mRNA表達(dá)量比較 血清GDF-15水平及腎組織GDF-15蛋白、mRNA表達(dá)量比較見表2。

表2 各組血清GDF-15水平及腎組織GDF-15蛋白、mRNA表達(dá)量比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與氯沙坦組比較，cP<0.05。

3 討論

NS因大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫及高脂血癥常導(dǎo)致血液濃縮、血液黏稠度增加，血液流速減慢從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧、損傷。因此，NS患者常存在高凝狀態(tài)，容易形成血栓發(fā)生栓塞進(jìn)而導(dǎo)致腎功能進(jìn)展[11]。阿霉素是一類具有足細(xì)胞毒性作用的蒽環(huán)類抗生素，ADR腎病模型最早于1982年由Bertani等[12]提出，此模型是國內(nèi)外公認(rèn)的腎病模型[13]，常用于誘導(dǎo)NS。

丹紅注射液主要成分是從丹參和紅花中提取出來[14]，丹參和紅花中的主要藥用成分就是丹紅注射液的主要成分。丹參中有效活性成分主要分為兩大類，一類為丹參酮類脂溶性化合物，另一類為丹參酚酸類水溶性化合物。而紅花的主要有效活性成分包括黃酮類化合物，如紅花黃色素等[15]。由于丹參具有活血、養(yǎng)血的作用，而紅花具有活血化瘀的效果，丹參和紅花同時(shí)使用，可以加強(qiáng)改善腎臟血液循環(huán)、抑制血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮以及抗氧化作用等功效[16～18]，對改善高粘血癥、腎小球局部高凝、改善腎小球?yàn)V過有肯定療效。所以，丹紅注射液在治療NS中發(fā)揮著重要的作用[19]。

生長分化因子-15(GDF-15)是應(yīng)激反應(yīng)性細(xì)胞因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)超家族的遠(yuǎn)端成員。正常生理?xiàng)l件下，GDF-15主要在胎盤和前列腺中高度表達(dá)但也在心臟、胰腺、肝臟、腎臟和結(jié)腸表達(dá)[20]。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以調(diào)控內(nèi)源性GDF-15的表達(dá)、分泌和儲存，當(dāng)病理狀態(tài)下例如缺氧、炎癥、急性組織損傷時(shí)[21,22]，多種細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)GDF-15 mRNA的表達(dá)[23]。在一項(xiàng)腎功能正常的2型糖尿病患者的病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，GDF-15的高表達(dá)可以預(yù)測腎臟白蛋白尿的進(jìn)展[24]。在另外一項(xiàng)研究[25]發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟病患者的GDF-15的表達(dá)與腎臟病進(jìn)展(即eGFR下降30%或ESRD的發(fā)展)相關(guān)，GDF-15濃度的變化可以預(yù)測腎功能進(jìn)展。

故本實(shí)驗(yàn)采用阿霉素腎病大鼠模型，造模成功后采用丹紅注射液進(jìn)行干預(yù)性治療后發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液治療后大鼠的24 h尿蛋白定量減少，血清白蛋白升高，血脂下降，肌酐、尿素氮指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，說明丹紅注射液能減少阿霉素腎病大鼠的尿蛋白，這與相關(guān)的臨床試驗(yàn)結(jié)果相吻合。此外我們還發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，丹紅組大鼠血清GDF-15表達(dá)明顯降低，腎組織中GDF-15 mRNA和蛋白的表達(dá)減少，腎小球硬化指數(shù)減低。提示丹紅注射液可以降低血漿及腎組織中的GDF-15的表達(dá)，并而降低腎小球硬化指數(shù)改善腎臟纖維化。

總之，丹紅注射液靜注對大鼠腎病有治療作用，其機(jī)制可能與抑制血清GDF-15及腎組織中GDF-15 mRNA、蛋白表達(dá)有關(guān)。