高低淋巴結轉移潛能鼻咽癌細胞與LEC共培養后目標細胞miR-92a-3p表達及其靶基因功能分析

蔣旭，劉琦，張瑩，姚茜，3，韋正波，謝瑩，3

1 廣西醫科大學生命科學研究院，廣西南寧530000；2 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院；3 廣西區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室

鼻咽癌(NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在東南亞尤其是中國南方地區高發[1]。早期淋巴結轉移是NPC的主要臨床特征，局部復發和遠處轉移是NPC患者預后不良的主要原因。因此，揭示NPC發展過程中淋巴結轉移的潛在分子機制具有重要的研究意義和臨床價值[2,3]。近年來，腫瘤微環境與腫瘤發生發展尤其是侵襲轉移的關系越來越受到學者的重視。NPC起源于鼻咽上皮，由于周圍解剖結構的特殊性，局部含有大量的淋巴組織，其中淋巴管內皮細胞(LEC)也是NPC局部微環境中的重要成員之一，LEC與NPC細胞的交互作用在NPC的侵襲和轉移中可能起到了非常重要的作用。

本課題組在前期的研究[4]過程中發現，NPC高淋巴結轉移細胞株5-8F的條件培養基明顯促進LEC的增殖，而LEC的條件培養基促使5-8F細胞的侵襲遷移能力增強，通過兩種細胞的共培養可以明顯促進細胞的運動和遷移，特別是直接接觸共培養尤為明顯。為了進一步研究其潛在作用，利用轉錄組測序技術檢測兩種細胞在共培養前后轉錄組水平的表達變化，我們發現miRNA-17-92基因簇在共培養后的兩種細胞中均表達改變。miRNA-17-92基因簇是典型的高度保守的多順反子miRNA簇，位于人類13號染色體13q31.3區域C13orf25的第三個內含子上，編碼六個成熟的miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a[5]，miR-17-92基因簇被多數學者認為是一種強效的原癌基因,也是原癌miRNA的典型代表[6]。多項研究[7]表明，miRNA-17-92基因簇的成員在各種疾病中，尤其是在不同類型的癌癥中存在特異性表達，提示miRNA-17-92基因簇與多種腫瘤的發生發展密切相關。有研究顯示，miR-92a與結直腸癌的淋巴結轉移相關，可能是結直腸癌的潛在標志物，而且miR-92a在膀胱癌[8]、結直腸癌[9]、肺癌[10]、宮頸癌[11]、食道鱗狀細胞癌[12]中表達增加并促進了腫瘤細胞的轉移。因此，為了進一步驗證NPC細胞與LEC交互作用下miR-92a-3p表達的改變對NPC淋巴結轉移的影響，我們設計了Transwell小室共培養體系，用不同轉移潛能的NPC細胞系與LEC進行Transwell共培養，觀察miR-92a-3p在共培養前后細胞中表達的差異，并利用生物信息學的方法對miR-92a-3p靶基因進行功能預測，探討其對NPC淋巴結轉移存在的潛在影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人NPC高淋巴結轉移細胞株5-8F和人NPC低淋巴結轉移細胞株6-10B購自湖南湘雅中心實驗室細胞庫。LEC購自北京裕恒豐科技有限公司，由美國Sciencell公司構建。DMEM培養基和胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，ECM培養基套裝購自美國Sciencell公司，青鏈霉素購自中國Solarbio公司

1.2 細胞培養 5-8F細胞和6-10B細胞分別培養于89%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素培養基中，LEC在88%ECM+10%FBS+1%ECGS+1%青鏈霉素培養基中培養，放在37℃、5%CO2的培養箱中進行常規培養。取對數生長期的5-8F細胞、6-10B細胞以及LEC進行常規消化后制成單細胞懸液。

1.3 細胞分組及Transwell共培養 采用0.4 μm孔徑的Transwell小室進行細胞共培養，將兩種細胞分別接種于上下室，采用6孔板進行單細胞培養，以共培養后的Transwell上室細胞和6孔板培養的單細胞為目標細胞。①在Transwell上室接種1×105個LEC，加入1.5 mL DMEM完全培養基，下室接種1×105個5-8F細胞，加入2.6 mL DMEM完全培養基，記為LEC+5-8F組；在Transwell上室接種1×105個LEC，加入1.5 mL DMEM完全培養基，下室接種1×105個6-10B細胞，加入2.6 mL DMEM完全培養基，記為LEC+6-10B組；在6孔板中接種2×105個LEC，并加入4.1 mL DMEM完全培養基，記為LEC組。②在Transwell上室接種1×105個5-8F細胞，加入1.5 mL DMEM完全培養基，下室接種1×105個LEC，加入2.6 mL DMEM完全培養基，記為5-8F+LEC組；在6孔板中接種2×105個5-8F細胞，并加入4.1 mL DMEM完全培養基，記為5-8F組。③在Transwell上室接種1×105個6-10B細胞，加入1.5 mL DMEM完全培養基，下室接種1×105個LEC，加入2.6 mL DMEM完全培養基，記為6-10B+LEC組；在6孔板中接種2×105個6-10B細胞，并加入4.1 mL完全培養基，記為6-10B組。

1.4 各組目標細胞中miR-92a-3p檢測 采用qRT-PCR法。各組細胞培養48 h時，使用miRNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板、以U6為內參，進行Realtime-PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30s，40個循環。以2-ΔΔCt表示細胞中miR-92a-3p的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 miR-92a-3p靶基因預測及KEGG通路分析 通過4個miRNA靶基因預測網站miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu)、miRWalk(http://129.206.7.150/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-92a-3p的靶基因，在Venny2.1.0網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取靶基因的交集，即為miR-92a-3p的靶基因。使用KOBAS3.0在線網站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對4個靶基因預測網站所共同預測的靶基因進行KEGG通路分析，選取P<0.05的通路用RStudio軟件作圖。

2 結果

2.1 各組目標細胞中miR-92a-3p的相對表達量比較 LEC+5-8F組、LEC+6-10B組、LEC組細胞中miR-92a-3p的相對表達量分別為605.00±119.00、46.30±11.40、1.01±0.16，組間相比，P均<0.05。5-8F+LEC組、5-8F組細胞中miR-92a-3p的相對表達量分別為212.00±39.40、1.00±0.08，組間相比，P<0.05。6-10B+LEC組、6-10B組細胞中miR-92a-3p的相對表達量分別為4.14±0.87、1.02±0.24，組間相比，P<0.05。

2.2 miR-92a-3p的靶基因預測結果 miR-92a-3p的靶基因預測結果見圖1。由圖1可知，有74個基因被4個miRNA靶基因預測網站共同預測為miR-92a-3p的靶基因，分別是FNIP1、SLC12A5、PTAR1、ZFC3H1、KLHL14、GOLGA3、CPEB3、SLC25A32、SGK3、ZFYVE21、ERGIC2、TECPR2、TRIM36、SYNJ1、RSBN1、ITPR1、MAP1B、PITPNA、ZDHHC5、TMF1、TEF、MOAP1、FAM20C、SOX11、DENND4B、TOB2、PDZD8、GOLGA4、LMBR1L、EVI5、BCAT2、DUSP10、RPL15、TULP4、TNPO1、FAM135A、RORA、YIPF4、PEAK1、WASL、NFYB、TRIO、SLC9A1、DMXL1、PIK3AP1、KLHL11、ATP7A、XYLT2、PER2、ARPC2、BMPR2、MYH9、NUFIP2、SETD5、TSC1、ATP2B4、GALNT7、PDS5B、DBT、IKZF2、SKI、WDR81、NFIB、SMAD7、DNAJC27、ATXN7、EIF4G2、NFATC2IP、TRAM2、UVRAG、AURKA、CREB3L2、GAA、ARFGEF2。

圖1 miR-92a-3p的靶基因預測結果

2.3 miR-92a-3p靶基因功能分析結果 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析結果見圖2。由圖2可知，miR-92a-3p的靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及鈣信號通路等與腫瘤轉移相關的通路上。

3 討論

自從1889年Stephen Paget[13]提出腫瘤的“種子-土壤”學說以來，腫瘤微環境與腫瘤發生發展特別是轉移的關系越來越受到學者們的重視。部分研究也表明腫瘤細胞會通過調節其轉移前微環境以達到促進細胞侵襲和轉移的作用，而且不同類型的腫瘤具有不同器官或組織的轉移偏好，如中國南部地區高發的NPC早期淋巴結轉移就是其主要臨床特征。NPC發生于患者的鼻咽腔內，其周圍微環境中存在著大量的淋巴樣組織及淋巴管組織，淋巴管的密度與淋巴結轉移密切相關，提示LEC與NPC的侵襲和轉移密切相關。LEC在腫瘤的侵襲和轉移過程中也起到了極其重要的作用，Pekkonen等[14]將人類黑色素瘤細胞暴露于LEC后使癌細胞更具侵襲性，這些癌細胞移植到小鼠體內后，更容易發生遠處器官轉移。本課題組前期的研究也發現NPC細胞與LEC的交互作用明顯促進細胞的侵襲和遷移，將5-8F細胞與LEC混合后接種，可以使移植瘤小鼠更快的發生淋巴結轉移，提示NPC細胞與LEC的交互作用在NPC的淋巴結轉移過程中起到了很重要的作用。

圖2 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析結果

miRNA是一類小的非編碼RNA，可以調節腫瘤的進展，尤其是侵襲和轉移的過程。腫瘤轉移是一個復雜而低效的過程。為了在遠離最初的原發腫瘤部位形成轉移，腫瘤細胞需要通過基底膜侵入、滲入血流，通過循環傳播，滲透到遠端組織或者器官，并適應新的生存和增殖的場所[15]。在每個步驟中，腫瘤細胞與其周圍的微環境發生緊密的相互作用。事實上，現在普遍認為，腫瘤細胞的轉移潛能是由其內在和外在的關系決定的，而miRNA的作用與調節兩者促進轉移相關[16]，miRNA可以通過改變癌細胞的內在特性，如細胞增殖、細胞凋亡等，參與腫瘤轉移過程。同時，miRNA也可以參與腫瘤轉移過程中不同微環境的形成，通過調節腫瘤微環境來調節腫瘤的轉移。miR-92a-3p是miR-17-92基因簇的主要成員之一。有研究[12]表明，miR-92a-3p與腫瘤的轉移和侵襲密切相關，且是腫瘤發生轉移的標志物，如miR-92a前體的轉染可以使人食管癌細胞系KYSE410的侵襲和遷移能力增強。miR-92a在非小細胞肺癌組織中高表達，尤其是發生轉移的組織中上調更為明顯[17]。miR-92a也可以作為結直腸癌的早期淋巴結轉移標志物，Jepsen[18]選擇T1期伴有(N+)或無(N0)淋巴結轉移的結直腸癌患者配對進行miRNA檢測，結果發現miR-17-3p和miR-92a-3p在伴有淋巴結轉移的樣本中明顯高表達。為了進一步研究miR-92a-3p在NPC淋巴結轉移中潛在作用，本實驗選擇用兩種不同轉移潛能的NPC細胞5-8F(高淋巴結轉移)和6-10B(低淋巴結轉移)分別與LEC共培養，結果發現兩種NPC細胞均可以刺激LEC內miR-92a-3p的表達上調，而高淋巴結轉移細胞株5-8F的刺激能力明顯強于低淋巴結轉移細胞株6-10B，我們推測具有不同轉移潛能的NPC細胞與LEC共培養后合成miR-92a-3p的能力不同可能與兩種細胞不同的轉移潛能相關，具有不同轉移潛能的NPC細胞可以在腫瘤微環境中調節miR-92a-3p的表達，從而促進NPC的淋巴結轉移。

隨后，為了進一步分析miR-92a-3p的作用靶點，本研究分別通過miRDB、miRTarbase、miRWalk、TargetScan四大在線工具預測hsa-miR-92a-3p靶基因。這些數據庫彼此之間的算法都各不相同，采用不同的數據庫同時對目的miRNA進行預測，做交集處理，可得到相對可靠的miRNA靶基因。對這些靶基因進行KEGG信號通路分析發現，這些靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及鈣信號通路等與腫瘤轉移侵襲相關的通路上。綜合文獻分析，Rao等[19]也證實miR-92a可以靶向亮氨酸重復蛋白磷酸酶(PHLPP2)，從而激活PI3K/Akt/mTOR途徑，協助T細胞淋巴瘤(MCL)抵抗化療誘導的凋亡；而下調miR-92a的表達可以抑制MCL移植瘤小鼠模型中腫瘤的生長。在心血管系統的研究方面發現，miR-92a還參與了內皮細胞損傷、動脈粥樣硬化等過程，在氧化應激的狀態下膽固醇調節元件結合蛋白SREBP2和miR-92a表達上調，或者通過靶向去乙酰化酶(SIRT1)、Kruppel樣因子KLF2和KLF4導致NOD樣受體家族熱蛋白結合域3炎癥因子激活和內源性NO合成酶抑制，導致內皮細胞的功能紊亂[20]。以上研究都提示miR-92a-3p可能參與到腫瘤細胞的多種生物學行為過程中，并對腫瘤微環境的調節起到了極其重要的作用，通過對預測靶點的深入研究將對進一步闡明NPC細胞侵襲與轉移的作用機制提供幫助。

總之，我們發現不同淋巴結轉移潛能的NPC細胞系與LEC共培養后細胞內miR-92a-3p表達升高，不同淋巴結轉移潛能的NPC細胞系與LEC共培養后細胞內miR-92a-3p的表達水平與兩種NPC細胞不同的淋巴結轉移潛能有關，提示miR-92a-3p可能是NPC發生淋巴結轉移的潛在標志物。通過4個在線miRNA靶基因預測網站找到了相對可靠的miR-92a-3p的靶基因,為后續進一步驗證miR-92a-3p在NPC腫瘤微環境中調節靶基因的表達，從而影響NPC淋巴結轉移提供了數據與理論支持。