表沒食子兒茶素沒食子酸酯對人宮頸癌細胞株CaSki增殖、凋亡及凋亡相關基因表達的影響觀察

吳宗妍，劉小敏，李金鴿

1 陜西省安康職業技術學院醫學院，陜西安康 725000；2西北婦女兒童醫院

宮頸癌是威脅婦女健康的常見惡性腫瘤之一，近年來死亡率呈逐年上升趨勢，其發病高峰年齡為40～60歲[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中最主要的活性成分，具有抗氧化、保護心血管、神經和抗病毒等作用，并且具有有效抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡的作用[2～4]。2018年3月～2019年7月，本研究觀察了EGCG對人宮頸癌細胞株CaSki增殖、凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人宮頸癌細胞株CaSki、RPMI-1640培養基、胎牛血清購自武漢博士德公司，EGCG、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，青霉素-鏈霉素(100×)溶液、胰酶細胞消化液購自碧云天公司，AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒購自中國艾美捷科技公司，TRIzol、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自天根公司。酶標儀、流式細胞儀購自美國BD公司，熒光定量分析儀購自瑞士羅氏公司。

1.2 細胞分組及EGCG給予 CaSki細胞采用內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期CaSki細胞分為實驗組和對照組，實驗組分別加入不同濃度(5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)的EGCG溶液和5%胎牛血清培養液，記為5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組；對照組加入等體積的5%胎牛血清完全培養液。

1.3 各組細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。取各組CaSki細胞接種于96孔板中，每組設5個復孔，培養48 h后，加入濃度為5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標儀測定各孔波長為490 nm處的光密度值(OD值)，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞凋亡率測算 取各組CaSki細胞接種于6孔板中，培養48 h后，吸棄上清液，4 ℃的PBS清洗細胞，胰酶消化后收集細胞，調整細胞密度為1×106/mL，取0.5 mL細胞懸液于1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，按照AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒說明書步驟進行染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 各組細胞凋亡相關基因半胱天冬氨酸酶-3(Caspase-3)、P53、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax) mRNA檢測 采用熒光實時定量PCR法。取各組細胞，繼續培養48 h后，TRIzol法提取總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板、以GAPDH為內參進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，40個循環。引物序列如下：Caspase-3上游引物為5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′，下游引物為5′-CTACAACGATCCCCTCTGAAAAA-3′；P53上游引物為5′-TCCTCCCCAACATCTTATCC-3′，下游引物為5′-GCACAAACACGAACCTCAAA-3′；Bax上游引物為5′-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′，下游引物為5′-TGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′；Bcl-2上游引物為5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC′-3′，下游引物為5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′；GAPDH上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中目的基因mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組、對照組CaSki細胞作用48 h后，細胞增殖抑制率分別為5.14%±0.54%、15.42%±1.22%、27.16%±2.11%、40.51%±1.57%、0，組間相比，P均<0.05。

2.2 各組細胞凋亡率比較 5 mg/L組、10 mg/L組、20 mg/L組、40 mg/L組、對照組CaSki細胞作用48 h后，細胞凋亡率分別為1.95%±0.21%、5.39%±1.54%、15.14%±2.12%、27.46%±3.50%、0.74%±0.21%，組間相比，P均<0.05。

2.3 各組細胞凋亡相關基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量比較 各組細胞凋亡相關基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞凋亡相關基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與5 mg/L組相比，﹟P<0.05；與10 mg/L組相比，△P<0.05；與20 mg/L組相比，▲P<0.05。

3 討論

由于中國人群經濟、文化等分布不平衡，人們對宮頸癌的預防、早診、早認識不足，導致其發病率和死亡率逐年升高。目前研究[5]發現，EGCG對人鼻咽癌、膀胱癌、黑色素瘤細胞瘤、多發性骨髓瘤、肺癌等惡性腫瘤的腫瘤細胞中具有一定促凋亡、抑增殖效果。但EGCG對宮頸癌的作用研究甚少，抑癌的機制尚不清楚。

EGCG是茶葉的主要活性物質。EGCG的抗癌機制主要表現在以下幾個方面[6]：①抑制蛋白激酶B(PKB)活性，下調細胞形成因子(IL-8)、金屬蛋白酶類(MMPs)，抗腫瘤血管形成；②調節周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(CDKs)，影響癌細胞的細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖；③抑制細胞轉錄因子中激活子蛋白-1(AP-1)、核因子(NF-κB)等，促進癌細胞凋亡；④調節癌細胞的信號通路，如PI3K/Akt通路、酪蛋白激酶(CK2)通路、受體絡氨酸激酶(PTKs)受體通路等，影響腫瘤細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。本研究將不同濃度的EGCG作用于人宮頸癌CaSki細胞，發現EGCG可明顯抑制宮頸癌細胞增殖并促進其凋亡，且EGCG對CaSki細胞的調節作用存在一定的濃度依賴性。

細胞凋亡調控的失衡可能是腫瘤發生發展的重要因素。線粒體凋亡是細胞凋亡的主要途徑之一，參與線粒體凋亡途徑的主要蛋白有：Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、細胞色素C蛋白、凋亡誘導因子AIF蛋白等。本研究進一步研究了EGCG作用CaSki細胞后，細胞內線粒體凋亡途徑有關的Caspase-3、Bax、Bcl-2基因和人體抑癌P53基因的變化。有研究[7]證實，Caspase-3蛋白是凋亡過程中主要執行蛋白之一。Caspase-3在細胞質內以非活化形式存在，當Caspase-3活化后，可以發揮切斷肽鏈作用，令細胞內重要的蛋白酶失活，導致細胞功能和形態發生變化使細胞凋亡。Caspase-3活化的一條途徑為：細胞內死亡配體與相對應的死亡受體結合形成三聚體，并暴露死亡受體的死亡結構域，激活Caspase-8或Caspase-10，通過級聯反應，激活Caspase-3；另一條途徑為細胞受到死亡刺激時，線粒體釋放細胞色素C(cyto-C)、凋亡誘導因子(AIF)等，進而活化Caspase-3[8]。BCL-2家族參與線粒體凋亡途徑。抑制細胞凋亡的Bcl-2基因與促進細胞凋亡的Bax基因相拮抗，影響線粒體膜通透性和膜電位，并調節Caspase家族蛋白，從而調控細胞的凋亡[9]。本研究通過qPCR檢測線粒體相關基因表達量的結果顯示，不同濃度的EGCG作用CaSki細胞能有效上調Caspase-3、Bax基因，下調Bcl-2基因，使CaSki細胞經線粒體途徑發生凋亡，這與Moradzadeh等[10]學者在急性早幼粒細胞白血病細胞體外研究結果一致。人體抑癌P53基因是一種轉錄因子，可以上調Bax的表達水平，以及下調Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用[11]。本研究結果表明，EGCG對CaSki細胞的凋亡具有調控作用，即通過線粒體凋亡途徑及抑癌P53基因的表達調節共同作用促進宮頸癌細胞凋亡。

綜上所述，綠茶多酚中最主要的活性成分EGCG可抑制CaSki細胞增殖，促進其凋亡；EGCG誘導CaSki細胞凋亡的作用與上調Caspase-3、P53、Bax基因、下調Bcl-2基因表達有關。EGCG廣泛的藥理作用較為復雜，需要進一步研究。