通竅活血湯灌胃對小鼠顱腦損傷的改善作用及其機制

杜勇，王革生，張淑敏，馬濤，張少輝，宋光榮，劉曉漢，周玉嘉

1 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2 民航總醫(yī)院；3 北京中醫(yī)藥大學

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是臨床上的常見疾病，是創(chuàng)傷患者死亡和致殘的主要原因[1～3]。TBI治療難度大、治療費用高，具有高致殘率、高致死率的特點，給個人、家庭以及社會在經濟、精神上都帶來了巨大的負擔[1, 4, 5]。因此，為該疾病尋找新的治療手段和方法，找到高效的治療藥物具有重要臨床和社會意義。由于TBI的原發(fā)性損傷無法逆轉，因此，控制TBI繼發(fā)性損傷至關重要。腦損傷后神經元丟失是導致繼發(fā)性損傷的主要原因，壞死和凋亡被認為是神經元損傷的主要形式[6, 7]。壞死發(fā)生在損傷即刻，凋亡則具有一定的緩沖期限，提示凋亡可以作為治療干預的生物學過程。自噬和凋亡之間存在一定的關聯(lián)性，研究[8]顯示，TBI能導致細胞自噬功能障礙，從而介導細胞死亡。藥物激活自噬可以抑制細胞凋亡，提示自噬是一個非常好的藥物作用靶點。細胞自噬包括大自噬、微自噬、核糖體自噬、聚集體自噬和線粒體自噬等多種亞型，其中線粒體自噬與疾病的關系是目前的研究熱點之一[9, 10]。線粒體是細胞的能量工廠，對于細胞維持正常生理代謝發(fā)揮著重要的作用。研究[11]顯示，TBI會促發(fā)線粒體功能紊亂，腦損傷后1～3 h即發(fā)生線粒體損傷，線粒體損傷和細胞存活、功能修復密切相關。線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的自噬過程，可以保護細胞免受損傷線粒體或者促凋亡因子的損害[12]。2018年8月10日～2019年6月25日，本研究觀察了通竅活血湯灌胃對小鼠顱腦損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組、顱腦損傷模型的建立及通竅活血湯的給予方法 60只小鼠隨機分為假手術組、模型組和治療組，每組20只。模型組和治療組小鼠稱重后用4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，頭部剪毛消毒，于頭皮正中切開，切口長2 cm，剝離右側顱頂骨膜，固定于小鼠腦立體定位儀上，用顱骨鉆刺一小孔，在左側頂骨處鉆一直徑4 mm的骨窗，暴露硬腦膜并使其完整，采用改良自由落體法，使用40 g砝碼從高20 cm處墜落撞擊于硬腦膜表面的圓柱體，建立顱腦損傷模型，逐層消毒、縫合頭皮后回籠飼養(yǎng)；假手術組麻醉后暴露骨窗，不擊打腦皮質，縫合頭皮后回籠飼養(yǎng)。各組小鼠建模后6 h開始給藥，三組均給予凝血酶、甘露醇尾靜脈注射，治療組同時給予通竅活血湯顆粒劑(17.2 g/kg)灌胃。

1.2 各組小鼠神經功能損傷程度評估 各組小鼠建模后24 h時，使用改良的神經功能缺損評分(mNSS評分)評估神經功能損傷程度。mNSS評分主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動，總分18分，缺少一項反射或動物不能完成一項任務加1 分。

1.3 各組小鼠腦組織水含量測定 每組小鼠在神經功能損傷程度觀察完畢后，各取3只處死，開顱去掉嗅球、小腦，取大腦損傷側的腦組織，用濾紙吸盡表面血漬，置于已烤干并稱重的錫紙上，用萬分之一電子天平稱濕重后，置入電熱恒溫干烘箱中，110 ℃下烘烤24～48 h至恒重，兩次稱重誤差小于0.1 mg后，得其干重，參照Ellion公式計算小鼠腦組織水含量。小鼠腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 各組小鼠腦組織細胞凋亡率測算 每組小鼠在神經功能損傷程度觀察完畢后，各取3只處死，取大腦損傷側的腦組織，在恒冷冰凍切片機內切片，再用冷丙酮在4 ℃固定10～20 min，PBS洗滌2次，滴加蛋白酶K工作液(20 μg/mL)，20～37 ℃反應15～30 min，PBS洗滌3次，加入50 μL TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS洗滌4次，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算綠色熒光細胞占總細胞的百分比，即為細胞凋亡率。

1.5 各組小鼠腦組織線粒體DNA(mtDNA)檢測 采用PCR法。取各組小鼠腦組織，勻漿后在4 ℃條件下800×g離心5 min，取上清液0.5 mL加入含0.5 mL線粒體蛋白抽提試劑盒溶液A的離心管中，4 ℃條件下15 000×g離心10 min，離心后的沉淀即為線粒體。往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重懸線粒體，4 ℃條件下15 000×g離心10 min，棄上清，每20 μL線粒體加入200 μL含有磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的冷裂解液，置于4 ℃搖床平臺上溫和振蕩15 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，上清液即為線粒體蛋白提取物。取線粒體蛋白提取物，采用SYBR Green法進行PCR擴增，引物序列如下：mtDNA正向引物為5′-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3′，反向引物為5′-AGAGTGCGTCATATGTTGTTC-3′；β-Actin正向引物為5′-GTGTTCTGTTTCTCCTGGCA-3′,反向引物為5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′。PCR反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中mtDNA的相對表達量。

1.6 各組小鼠腦組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62及錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型(COX Ⅳ)、切割活化的半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)、凋亡抑制基因Bcl-2蛋白檢測 采用Western Blotting法。取各組小鼠腦組織置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加含PMSF單去污劑裂解液于勻漿器中進行勻漿，裂解30 min后移至離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取上清與5倍蛋白上樣緩沖液混合后，放入沸水中變性10 min，冷卻至室溫，120 V恒壓凝膠電泳后進行轉膜，轉膜后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡，室溫搖床封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，加入HRP標記的相應二抗，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，運用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。獲得LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白相對表達量后，計算LC3 Ⅱ/Ⅰ。LC3 Ⅱ/Ⅰ=LC3-Ⅱ蛋白相對表達量/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能損傷程度比較 假手術組、模型組、治療組mNSS評分分別為(2.00±0.47)、(15.00±0.47)、(6.00±0.94)分，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯有效地緩解了小鼠神經功能損傷情況。

2.2 各組小鼠腦組織水含量比較 假手術組、模型組、治療組腦組織水含量分別為74.4%±0.36%、84.2%±0.64%和79.5%±0.70%，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯有效降低了小鼠腦組織水含量。

2.3 各組小鼠腦組織細胞凋亡率比較 假手術組、模型組、治療組細胞凋亡率分別為9.60%±1.87%、35.70%±6.61%和21.50%±5.19%，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯可降低小鼠腦組織細胞凋亡率。

2.4 各組小鼠腦組織mtDNA相對表達量比較 假手術組、模型組、治療組腦組織mtDNA相對表達量分別為1.028±0.233、0.040±0.003和0.510±0.201，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯可以緩解由腦損傷所導致的mtDNA相對表達量減少。

2.5 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較見表1。由表1可知，與假手術組相比，模型組和治療組LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相對表達量均顯著降低，p62、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高；與模型組相比，治療組LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相對表達量均顯著升高，p62、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低。

表1 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較

注：與假手術組相比，＊P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

TBI是臨床常見疾病，多由事故災害以及運動損傷導致患者腦細胞神經元功能和結構的損傷[9]，可造成外界適應能力、感知能力和認知能力不同程度的降低，但其作用機制尚不清楚。 有研究[13,14]認為，通竅活血湯中的多種有效成分均起到了減輕顱腦損傷的作用，對腦損傷動物表現(xiàn)出保護作用，如川穹、紅花和桃仁可以改善血液流變，麝香具有解毒活血以及開通諸竅的功能。本研究對通竅活血湯治療TBI的機制進行了探討，揭示了通竅活血湯在改善腦水腫等方面的作用及機制，為通竅活血湯臨床治療TBI提供更多的實驗及理論依據。

mNSS評分從反射、平衡、感覺以及運動等幾個方面評判小鼠神經功能損傷程度，小鼠的mNSS評分越高說明神經功能損傷程度越嚴重。本研究結果顯示，模型組小鼠較假手術組的mNSS評分顯著升高，經過通竅活血湯治療后mNSS評分顯著降低，說明通竅活血湯可以使小鼠的神經功能損傷程度得到有效地改善。我們還檢測了小鼠的腦水腫情況，通過通竅活血湯治療后小鼠的腦組織水含量顯著降低，提示通竅活血湯對顱腦損傷的治療具有顯著影響。

近年來研究[13,14]表明，通竅活血湯對多種疾病的治療作用可能是通過激活線粒體自噬，從而介導疾病的發(fā)生發(fā)展。然而通竅活血湯對顱腦損傷的治療作用是否與線粒體自噬密切關聯(lián)目前尚未見報道。但已有研究[15,16]表明，褪黑激素通過mTOR途徑激活線粒體自噬，減輕腦損傷炎癥，改善神經元死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯治療的小鼠能夠促進LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型的轉換。自噬激活后，LC3-Ⅱ形成并位于自噬體膜的表面，是特異性表達于自噬體的分子標志蛋白，用于檢測自噬水平，LC3 Ⅱ/Ⅰ的升高也提示了通竅活血湯可以促進細胞自噬的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯緩解了由于顱腦損傷所導致的p62蛋白的表達升高。p62蛋白參與信號轉導、自噬與蛋白降解以及線粒體自噬，說明通竅活血湯可能通過提高p62蛋白的表達從而提高細胞自噬水平。

線粒體參與細胞內的能量供給，是細胞內重要的細胞器[17]。線粒體自噬是通過自噬清除細胞內受損線粒體。我們發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯治療后的小鼠腦組織中的MnSOD和COX Ⅳ的表達均呈現(xiàn)上升趨勢，提示我們通竅活血湯可能促進了線粒體自噬的發(fā)生。研究[6,12]顯示，自噬可以保護細胞免于受到外界刺激后引起的細胞凋亡，提示細胞自噬可以促進細胞的存活。本研究結果顯示，通竅活血湯能夠有效緩解由顱腦損傷導致的Bcl-2表達的下降和cleaved Caspase-3表達的上升，提示通竅活血湯通過激活線粒體自噬從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，通竅活血湯灌胃可改善小鼠顱腦損傷情況，其作用機制可能與激活線粒體自噬、抑制細胞凋亡有關。本研究揭示了通竅活血湯改善顱腦損傷的機制作用，可以為顱腦損傷的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據。