臨床罕見的類孟買血型檢測鑒定(附1例報告)

潘英芳，徐群，孫昌魁，宋永紅，李京，呂紅娟，周娜，喬文本

山東省血液中心，濟南250014

人類血型抗原的編碼表達在遺傳過程中受多種因素調控，不同程度的突變誘發(fā)各種血型變異體及罕見稀有血型的形成。在已發(fā)現(xiàn)的39個人類血型系統(tǒng)中，ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中最為重要，現(xiàn)行的臨床輸血技術規(guī)范，也早已明確規(guī)定受血者及供血者的ABO血型為輸血必檢項目[1,2]。ABO血型鑒定一般采用ABO血型正反定型實驗。正定型，又稱細胞定型，是指采用定型試劑和被檢細胞反應所鑒定出的ABO血型；反定型，又稱血清定型，是指用被檢者血清和已知ABO血型的試劑紅細胞進行的反應所鑒定出的ABO血型。兩實驗結果判讀一致，方可準確定義A、B、O或AB血型，若兩實驗結果不符則稱ABO血型正反定不符，常考慮ABO亞型、罕見稀有血型、室溫性不規(guī)則抗體干擾或疾病等因素所致。2019年6月，我們發(fā)現(xiàn)1例獻血者外周血樣本的ABO血型正反定型結果不符，血型鑒定困難，隨即對其進行基因測序，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 外周血樣本及試劑 山東省血液中心檢驗科送檢的獻血者外周血樣本5 mL，初檢獻血者ABO血型正定型反應表現(xiàn)為O型，反定型反應表現(xiàn)為A型，ABO血型正反定不符，血型鑒定困難。單克隆抗-A抗體、單克隆抗-B抗體，Ac、Bc、Oc試劑紅細胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，抗人球蛋白試劑、血型不規(guī)則抗體篩選細胞、血型不規(guī)則抗體鑒定譜細胞、抗-H抗體、抗-Lea抗體、抗-Leb抗體試劑購自荷蘭Sanquin公司。

1.2 血型免疫血清學檢測方法

1.2.1 ABO血型鑒定 包括正定型和反定型。①正定型：取潔凈小試管2支，分別標明抗A、抗B，用滴管分別加入抗A、抗B血清2滴于試管底部，再以滴管分別加入獻血者3%～5%的紅細胞鹽水懸液1滴混勻，以1 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結果。②反定型：取潔凈小試管3支，分別標明A、B和O型細胞，用滴管分別加入獻血者3%～5%的紅細胞鹽水懸液2滴于試管底部，再以滴管分別加入A、B和O型3%～5%試劑紅細胞懸液1滴混勻，以1 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結果。

1.2.2 紅細胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鑒定 取3支潔凈試管，分別標注抗-H、抗-Lea、抗-Leb，各管分別加入相應的抗血清試劑1滴和獻血者3%～5%紅細胞懸液50 μL，3 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結果。

1.2.3 紅細胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原檢測 用生理鹽水洗滌1 mL獻血者紅細胞和1 mL O型獻血者紅細胞3次，移除上清液，分別加入1 mL抗-A抗體試劑、抗-B抗體試劑、抗-H抗體試劑，充分混勻紅細胞和抗血清，4 ℃孵育過夜，離心后移除上層抗血清，將紅細胞轉入干凈試管，用4 ℃預冷生理鹽水洗滌紅細胞6次，留取壓積紅細胞，加入同等量的生理鹽水56 ℃熱放散，離心后分離所得的上清液即為放散液。取干凈試管，分別加入放散液2滴和1滴試劑Ac細胞、試劑Bc細胞、試劑Oc細胞，離心后觀察并判讀結果。

1.2.4 不規(guī)則抗體篩查和鑒定 取潔凈小試管，分別標注Oc1、Oc2、Oc3，加入Oc1、Oc2、Oc3試劑細胞各1滴，再以滴管分別加入獻血者血清各2滴，以1 000 r/min離心15 s，觀察并記錄結果；將上述試管置于4 ℃冰箱中，靜置10 min后再次離心，觀察并記錄結果；再將試管置于37 ℃水浴30 min，取出離心后觀察并判讀結果；然后洗滌細胞3次，滴加2滴抗人球蛋白試劑，離心后觀察并記錄結果。

1.3 基因測序 使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取獻血者血液基因組DNA，測定其濃度和純度后，送天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司鑒定其ABO血型基因型并對FUT1基因進行測序。

2 結果

2.1 血型免疫血清學檢測結果 ABO血型鑒定結果顯示，獻血者ABO血型正定型反應表現(xiàn)為O型，反定型反應表現(xiàn)為A型，正反定型結果不符。紅細胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鑒定結果顯示，獻血者紅細胞上未檢測到H抗原，Lea抗原陰性、Leb抗原陽性，Lewis血型系統(tǒng)定型為Le(a-b+)，初步考慮該獻血者血型為孟買血型。紅細胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原檢測結果顯示，獻血者紅細胞僅吸收放散出抗-A抗體，推斷該獻血者血型可能為A型類孟買血型。不規(guī)則抗體篩查和鑒定結果顯示，在4 ℃與室溫條件下，鹽水介質中不規(guī)則抗體反應均呈陽性；在37 ℃條件下，鹽水介質及抗人球蛋白介質均呈陰性，推斷該不規(guī)則抗體為室溫性抗H抗體。

2.2 基因測序結果 獻血者ABO血型基因型為AA型。FUT1基因測序結果見圖1。由圖1可知，F(xiàn)UT1基因第四外顯子第658位點發(fā)生了C堿基突變?yōu)門堿基的改變，即c.658 C>T，且該突變?yōu)榧兒贤蛔儯袛喃I血者血型為A型類孟買血型。

圖1 FUT1基因測序結果

3 討論

血型是由特異性同種抗體檢測的紅細胞表面的遺傳特性表現(xiàn)[3]，正確的血型鑒定是保證臨床安全用血的關鍵，由于ABO血型抗原的強度是所有人類血型系統(tǒng)抗原中免疫原性最強的，且A、B、O血型個體體內存在相應的抗-A和(或)抗-B抗體，一旦ABO血型鑒定不準確造成ABO錯誤輸血，誘發(fā)體內抗原抗體凝集反應即可發(fā)生急性或速發(fā)型溶血性輸血反應，受血者可出現(xiàn)不同程度的寒戰(zhàn)、高熱、輸注無效甚至休克，嚴重者可危及生命，因此準確的ABO血型定型格外重要，是保證安全有效輸血的前提。在臨床實踐中，我們經常碰見血型鑒定困難的案例，干擾ABO血型鑒定的因素主要歸類為：正反定不符、弱抗原的存在、不同試劑鑒定結果難以統(tǒng)一、不規(guī)則抗體的存在等。本研究案例綜合了正反定不符和弱抗原存在兩大難點，我們借助于免疫血清學技術和分子生物學技術準確判定該獻血者血型為A型類孟買血型。美國輸血協(xié)會定義稀有血型是指該血型在人群中的概率為1/1 000，而血型在人群中概率低于1/5 000則稱為罕見血型。參照研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)[4]，歐洲人孟買血型、類孟買血型的概率為1/1 000 000，日本人概率為1/15 000，印度人概率為1/10 000，在我國鮮有報道，因此孟買血型及類孟買血型是極為罕見的稀有血型。

1952年，Bhende在印度孟買發(fā)現(xiàn)一例H基因缺陷型血型，血清學表現(xiàn)為紅細胞表面未檢測到A、B、H抗原，同時血清中存在抗-A、抗-B、抗-H抗體，最終將其命名為孟買血型。這是孟買血型首次被發(fā)現(xiàn)。1961年，有專家發(fā)現(xiàn)1例與孟買血型相似，但紅細胞上存在少許A抗原且唾液中可檢測到微量H抗原的血型,該血型被定義為類孟買血型[5～7]。針對本例獻血者，免疫血清學實驗結果顯示，紅細胞表面未檢測到A、B、H抗原，血清中存在不規(guī)則抗體，經鑒定為抗H抗體，因此我們初步考慮該獻血者為類孟買血型，同時借助于紅細胞吸收放散實驗，檢測出較弱的A抗原表達，因此推論該獻血者為A型類孟買血型，這也是山東省在獻血者群體中首次發(fā)現(xiàn)類孟買血型。

隨著研究的不斷深入，孟買血型、類孟買血型抗原合成、分泌、表達等一些分子機制也逐漸被揭開[8,9]。調控H抗原編碼表達的基因屬巖藻糖基轉移酶(FUT)家族，其中FUT1、FUT2、FUT3三個基因參與ABH抗原物質的表達。FUT1和FUT2基因有較高的同源性，均位于19q13.33，F(xiàn)UT1基因決定細胞膜上H抗原的表達，F(xiàn)UT2基因決定分泌液中H抗原的表達，而FUT2和FUT3兩個基因協(xié)同決定Lewis抗原的產生[10，11]。H基因變異存在遺傳異質性和基因多態(tài)性，當FUT1及FUT2基因發(fā)生突變時，可致紅細胞膜上和分泌物中均缺乏ABH抗原，此時該血型為孟買血型；當FUT1基因突變失活、FUT2基因正常，可致紅細胞膜上ABH抗原缺失，分泌物中尚存在ABH抗原，此時該血型為類孟買血型。目前發(fā)現(xiàn)的FUT1突變有60多種，在中國人群中，F(xiàn)UT1基因比較常見的突變種類主要是547-552delAG(即h1型)、880-882delTT(即h2型)，以及近幾年發(fā)現(xiàn)的658 C>T(即h3型)和35C-T(h4型)[12,13]。考慮到免疫血清學在疑難血型鑒定中存在一定的局限性，我們對該獻血者紅細胞FUT1基因進行了檢測，獻血者基因測序結果顯示，F(xiàn)UT1基因的658位點C堿基突變?yōu)門堿基，符合h3型突變。

研究[14]顯示，在FUT2和FUT3基因互相作用下，類孟買血型的紅細胞Lewis血型往往表現(xiàn)為Le(a-b+)或者Le(a-b-)。本研究中，我們也對該獻血者紅細胞Lewis抗原表型進行了檢測，結果顯示該獻血者紅細胞Lewis表型為Le(a-b+),符合類孟買血型Lewis血型系統(tǒng)表現(xiàn)型。

臨床實踐中，常規(guī)的血清學ABO血型初篩定型時，類孟買血型樣本正定型反應往往表現(xiàn)為紅細胞抗原與抗-A/抗-B試劑反應無凝集，而反定型試驗血清中一般可以檢測到稍弱的抗-A抗體和(或)抗-B抗體，因此，類孟買血型在ABO血型初篩過程中經常被錯誤的定型為O型。而由于該獻血者血清中存在弱抗-H抗體，當該獻血者作為受血者輸入普通O型紅細胞時，可能發(fā)生急性輸血反應。而作為獻血者，該獻血者的紅細胞及血清一旦輸入O型受血者體內，同樣會發(fā)生不可預測的輸血反應[15～17]。因此，針對本例罕見稀有血型獻血者紅細胞，我們建議將獻血者紅細胞冰凍保存，一旦同類血型緊急用血時，可以解凍該紅細胞，同時我們也聯(lián)系家屬，建議其親屬也進行血型檢測，有助于緊急情況下的互助使用。另外，在獻血者知情同意的基礎上，我們也將其信息編入山東省血液中心臨床輸血稀有血型庫以備不時之需。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1例臨床罕見的A型類孟買血型；對臨床鑒定困難且懷疑為罕見類孟買血型的血液樣本，在免疫血清學方法鑒定不能明確的情況下，可進行基因檢測明確其血型，指導臨床用血。隨著醫(yī)療手段的不斷更新，針對疑難血型，借助于常規(guī)免疫血清學實驗方法的同時，必要時需融入基因檢測技術[18]；另一方面，由于電子配血的跟進,人類稀有血型庫的建設也迫在眉睫。本例類孟買血型獻血者的發(fā)現(xiàn)，豐富了山東稀有血型庫的多樣性[19]。我們呼吁全國血液儲備單位，建立互聯(lián)網稀有血型信息分享機制，包括成立類似RhD陰性稀有血型聯(lián)盟、組建罕見稀有血型微信群，關鍵時刻實現(xiàn)無償互助獻血，以便解決稀有血型用血困難的問題。