基于適配體/金納米粒子的“開-關(guān)”型熒光探針快速測定水胺硫磷

鄒小波 蔣彩萍 李志華 孫悅 石吉勇 李艷肖 黃曉瑋 張迪 胡雪桃 翟曉東 魏曉鷗

摘?要?基于適配體和金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）合成“開-關(guān)”型熒光探針，用于快速、靈敏、高選擇性測定水胺硫磷。5'端連接熒光素（6-Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）的發(fā)卡型水胺硫磷適配體互補(bǔ)鏈（Complementary strand，cDNA）通過修飾于3'端的巰基連接到AuNPs表面，F(xiàn)AM（熒光信號分子）與AuNPs（熒光猝滅劑）間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng) （Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），導(dǎo)致熒光猝滅。加入水胺硫磷適配體（Isocarbophos-binding aptamer，ICP-Aptamer）與cDNA雜交，cDNA發(fā)卡構(gòu)型被打開，使熒光信號恢復(fù)。當(dāng)體系中存在水胺硫磷時，ICP-Aptamer與其特異性結(jié)合，導(dǎo)致與cDNA解離，cDNA發(fā)卡型結(jié)構(gòu)重新恢復(fù)，使熒光信號猝滅。采用透射電鏡、紫外-可見光譜、Zeta電位表征納米粒子特性，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間和溫育溫度。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，在0.02～10 μmol/L線性范圍內(nèi)，水胺硫磷濃度與熒光抑制率呈良好的線性關(guān)系，檢出限為17.8 nmol/L（3σ）。將此熒光探針應(yīng)于大米、菠菜樣品中水胺硫磷的測定，回收率均為92.9%～107.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.2%，表明此熒光探針在農(nóng)藥的檢測和食品安全的監(jiān)測中具有潛在的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞?熒光探針;“開-關(guān)”型;適配體;金納米粒子;水胺硫磷

1?引 言

有機(jī)磷農(nóng)藥作為應(yīng)用最廣泛的一類化學(xué)農(nóng)藥，常被用作殺菌劑、除草劑和殺蟲劑[1]。然而，由于有機(jī)磷農(nóng)藥的半衰期長，不當(dāng)?shù)氖褂眉疤幚砭鶗?dǎo)致其在農(nóng)作物、環(huán)境和水資源中殘留，甚至?xí)ㄟ^食物鏈富集于人畜體內(nèi)，危害人體健康，導(dǎo)致不孕、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[2]。水胺硫磷是一種被普遍應(yīng)用的乙酰膽堿酯酶抑制劑有機(jī)磷農(nóng)藥，具有廣譜的高殺蟲毒性，主要用于防治鱗翅目、同翅目和螨類害蟲。由于其高毒性，水胺硫磷雖仍廣泛施用于棉花和水稻作物中，但現(xiàn)已被我國禁用于果蔬和茶葉中[3]。然而，在一些地區(qū)，水胺硫磷仍被發(fā)現(xiàn)大量殘留于果蔬、大米等多種農(nóng)作物中。因此，建立快速、靈敏、簡便、高效的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

目前，對水胺硫磷的檢測主要采用儀器分析技術(shù)[4]，例如高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC[5]）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS[6]）等，以及免疫學(xué)檢測技術(shù)例如酶聯(lián)免疫吸附法[7]、免疫親和柱法[8]等。 這些分析方法分離能力高、靈敏度高、定量精確，但樣品前處理過程復(fù)雜、成本高、費(fèi)時長，需專業(yè)人員操作處理。與熒光光譜法[9]、拉曼光譜法[10]以及電化學(xué)信號[11]相結(jié)合的納米探針，因其具有響應(yīng)速度快、成本低、特異性好等特點(diǎn)而備受關(guān)注。納米生物探針結(jié)合了納米材料與生物活性物質(zhì)，采用酶[12]、抗體[13]等生物分子作為識別元件，特異性識別待檢測物質(zhì);同時，基于納米材料（如金納米粒子[13]、碳量子點(diǎn)[14～15]、石墨烯[16～17]、聚苯胺[18]、磁性納米粒子[19～20]等）轉(zhuǎn)換或增強(qiáng)其傳感信號。

酶、抗體等生物活性分子制備困難，對環(huán)境因素敏感，對檢測的準(zhǔn)確性有較大影響。功能性核酸（如適配體）因具有易于制備、低免疫原性、高化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[21]。Taghdisi等[22]制備了基于金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）、發(fā)卡型結(jié)構(gòu)的適配體互補(bǔ)鏈以及硫堇的電化學(xué)適配體探針，當(dāng)目標(biāo)物Pb2+存在時，適配體互補(bǔ)鏈形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，硫堇-AuNPs絡(luò)合物無法與其復(fù)合，導(dǎo)致體系產(chǎn)生微弱的電化學(xué)信號;當(dāng)不存在目標(biāo)物Pb2+時，硫堇-AuNPs絡(luò)合物與適配體互補(bǔ)鏈共軛復(fù)合，體系產(chǎn)生強(qiáng)電化學(xué)信號。Emrani等[23]構(gòu)建了以發(fā)卡型結(jié)構(gòu)的適配體體系為識別元件的熒光探針，用于檢測可卡因，檢出限低至0.07 ng/mL。

本研究以6-羧基熒光素（6-Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）為熒光信號分子，AuNPs為熒光猝滅劑，水胺硫磷適配體（Isocarbophos-binding aptamer，ICP-Aptamer）為識別元件，發(fā)卡型水胺硫磷適配體互補(bǔ)鏈（Complementary strand，cDNA）為結(jié)構(gòu)型“信號開關(guān)”，制備了可特異性識別水胺硫磷的“開-關(guān)”型熒光探針。此熒光探針通過發(fā)卡型cDNA的構(gòu)型變化，以及FAM-AuNPs供受體間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），將水胺硫磷的含量信息轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的熒光信號，實(shí)現(xiàn)水胺硫磷的定量檢測，并將此“開-關(guān)”型熒光探針用于大米和菠菜中水胺硫磷的定量檢測。

2?實(shí)驗(yàn)方法

2.1?儀器、試劑與材料

VIS-7220N可見分光光度儀（北京瑞利分析儀器有限公司）;F-98熒光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）;QuantaMasterTM 40熒光光譜儀（美國PTI公司）;JEM-2100透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）;Nano ZS90納米粒度儀及Zeta電位儀（英國馬爾文公司）;TGL-15B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

HAuCl4·4H2O、檸檬酸三鈉、十二烷基硫酸鈉、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（Tris （2-carboxyethyl） phosphine hydrochloride，TCEP）、二水合雙（對-磺酰苯基）苯基膦化二鉀鹽（Bis （p-sulfonatophenyl） phenylphosphine dihydrate dipotassium salt，BSPP）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）等試劑均購自鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司。ICP-Aptamer （序列5'-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3'）、5'和3'端分別修飾有FAM、巰基的cDNA（序列5'-FAM-CTGCACAAGAATCGCTGCAG-C3-SH-3'）[24]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。水胺硫磷、毒死蜱、敵敵畏、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、三唑磷、敵百蟲、啶蟲脒、吡蟲啉等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為采用Easypure 超純水系統(tǒng)純化的超純水。

大米、菠菜樣品購自鎮(zhèn)江市超市。

2.2?“開-關(guān)”型熒光探針的制備

2.2.1?AuNPs的制備?參考Frens-Turkevich方法[25]并稍作改進(jìn)，通過檸檬酸鹽還原HAuCl4·4H2O的方法制備13 nm AuNPs。將10 mL 1 mmol/L HAuCl4·4H2O溶液加入帶有回流冷凝器的圓底燒瓶中，置于恒溫電磁攪拌器，水浴加熱至劇烈沸騰，迅速加入1 mL 60 mmol/L 檸檬酸三鈉，溶液顏色由淡黃色變?yōu)闊o色。在100℃條件下劇烈攪拌15 min，至溶液變?yōu)榫萍t色。停止加熱，冷卻至室溫。加入3 mg BSPP，并繼續(xù)攪拌15 min，防止顆粒聚集。將得到的AuNPs過0.22 μm濾膜，于4℃保存，備用。

2.2.2?熒光探針的制備?將合成的AuNPs以10000 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀物重懸于4.5 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.0，含0.01% 十二烷基硫酸鈉（SDS））。將10 μL 500 mmol/L醋酸緩沖溶液（pH 5.2）、20 μL 10 mmol/L TCEP（現(xiàn)配現(xiàn)用）和100 μL 100 μmol/L cDNA混合均勻，在室溫下孵育1 h，然后與上述AuNPs溶液混合，室溫下避光孵育過夜。

向上述反應(yīng)溶液中加入50 μL 10 mmol/L PBS （pH 8.0，0.01% SDS，100 mmol/L NaCl），在室溫下孵育30 min，使cDNA與AuNPs復(fù)合。5000 r/min離心10 min，去除多余的cDNA。

將cDNA-AuNPs復(fù)合物重懸于10 mmol/L PBS（pH 8.0）中，使cDNA-AuNPs復(fù)合物終濃度為500 nmol/L。 在500 μL上述復(fù)合溶液中[26，27]，加入10 μL 40 μmol/L ICP-Aptamer和10 μL 10 mmol/L PBS（pH 8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mol/L MgCl2，50 mmol/L Tris），60℃溫育10 min，冷卻至室溫，即達(dá)到熒光探針溶液的動態(tài)平衡。

2.3?水胺硫磷的檢測

將不同濃度的水胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μmol/L）分別與上述熒光探針溶液混合，靜置10 min，測定熒光光譜，激發(fā)波長為495 nm。 按公式（1）計(jì)算熒光抑制率（Inhibition ratio，IR），重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

2.4?大米和菠菜樣品中水胺硫磷的檢測

在10 g大米樣品中加入5 mL去離子水和20 mL乙腈，勻漿10 min后，再超聲處理30 min，使其混合均勻。過濾，65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，進(jìn)行濃縮。用PBS（pH 8.0）將濃縮液稀釋100倍，過0.22 μm濾膜，備用。菠菜樣品的預(yù)處理方法與大米樣品一致。按照2.3節(jié)方法對樣品中水胺硫磷進(jìn)行檢測，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

3?結(jié)果與分析

3.1?檢測原理

基于發(fā)卡型cDNA的構(gòu)型變化以及FAM-AuNPs供受體間的FRET效應(yīng)的“開-關(guān)”型熒光探針檢測水胺硫磷的原理如圖1所示。其中，ICP-Aptamer為識別元件，F(xiàn)AM為熒光信號分子，AuNPs為熒光猝滅劑，cDNA為結(jié)構(gòu)型“信號開關(guān)”。

3'端的巰基將發(fā)卡型cDNA通過AuS鍵連接到AuNPs上。由于發(fā)卡型cDNA5'端熒光信號分子FAM靠近猝滅劑AuNPs的表面，F(xiàn)AM與AuNPs之間的FRET效應(yīng)成功猝滅了FAM的熒光信號。隨著ICP-Aptamer的加入，ICP-Aptamer與cDNA互補(bǔ)雜交，cDNA發(fā)卡型結(jié)構(gòu)被打開，F(xiàn)AM遠(yuǎn)離AuNPs表面，不再發(fā)生FRET，因此，伴隨顯著的熒光“開啟”，在495 nm激發(fā)波長下的FAM熒光信號恢復(fù)。當(dāng)檢測體系中加入靶標(biāo)水胺硫磷后，ICP-aptamer與水胺硫磷之間的特異性親和力使得ICP-aptamer優(yōu)先與水胺硫磷結(jié)合，從而造成ICP-aptamer與互補(bǔ)的cDNA發(fā)生解鏈，cDNA發(fā)卡型結(jié)構(gòu)重新恢復(fù)，F(xiàn)AM與AuNPs之間的FRET效應(yīng)使熒光信號猝滅，熒光“關(guān)閉”。

3.2?AuNPs和熒光探針的表征

如圖2A和2B的電鏡圖所示，所制備的AuNPs呈現(xiàn)良好的單分散狀態(tài)。隨著發(fā)卡型cDNA組裝到AuNPs表面，復(fù)合粒子的水動力半徑由12.8 nm增加到19.8 nm。由于ICP-Aptamer體系的相對剛性結(jié)構(gòu)對體系的保護(hù)以及體系達(dá)到的動態(tài)平衡，復(fù)合粒子趨于規(guī)則且穩(wěn)定的條帶狀分布。由圖2C可知，隨著AuNPs和cDNA的復(fù)合，復(fù)合粒子的共振吸收峰相比AuNPs發(fā)生紅移（由521 nm紅移至534 nm），峰強(qiáng)變強(qiáng)，進(jìn)一步表明發(fā)卡型cDNA成功修飾到了AuNPs表面[28]。通過測定Zeta電位值可進(jìn)一步探明AuNPs和cDNA復(fù)合過程中體系的穩(wěn)定性和復(fù)合粒子的表面狀況[29]。所制備的AuNPs表面帶負(fù)電（22.07 mV），當(dāng)發(fā)卡型cDNA通過巰基連接到AuNPs上時，Zeta電位為45.48 mV，體系狀態(tài)逐漸趨于平衡和穩(wěn)定，復(fù)合粒子粒徑變大。

3.3?熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系

“開-關(guān)”型熒光探針通過cDNA-AuNPs供受體間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)[30，31]，實(shí)現(xiàn)檢測體系熒光信號的“開啟”和“關(guān)閉”。在此檢測體系中，F(xiàn)AM作為熒光供體，AuNPs作為受體。如圖3A所示，F(xiàn)AM的熒光發(fā)射峰和AuNPs的紫外吸收峰分別為518和521 nm，兩峰幾乎完全重疊;當(dāng)cDNA通過3'端的巰基連接到AuNPs上時，cDNA由于自身堿基互補(bǔ)配對形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，5'端連接的FAM靠近AuNPs，AuNPs猝滅FAM熒光。通過公式（2）估算FRET猝滅效率（Q）：

式中，F(xiàn)0' 表示FAM的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)'為FAM-AuNPs復(fù)合粒子的熒光強(qiáng)度，B是背景熒光強(qiáng)度。

加入AuNPs后，Q>83%，表明 AuNPs 對 FAM熒光有較好的猝滅作用。熒光壽命可作為評判一個FRET體系的關(guān)鍵因素，通過圖3B可從熒光壽命衰減動力學(xué)角度分析cDNA-AuNPs 的FRET體系。加入AuNPs后，F(xiàn)AM的熒光壽命由4.11 ns下降為3.37 ns，且熒光被有效猝滅，表明FAM-AuNPs供受體間為動態(tài)猝滅[32]。

3.4?實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間和溫育溫度等因素均會影響熒光探針檢測靈敏性和準(zhǔn)確性。除pH值、ICP-Aptamer濃度、溫育時間、溫育溫度以外，固定其它實(shí)驗(yàn)條件，向反應(yīng)溶液加入適量 5 μmol/L水胺硫磷溶液，混合均勻。在同一體系中，通過比較熒光抑制率衡量熒光探針性能。在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)，測定不同pH值下檢測體系在水胺硫磷加入后的的熒光抑制率，結(jié)果如圖4A所示，當(dāng)體系pH值為8.0時，其熒光抑制率最大;當(dāng)pH值過高或過低時，由強(qiáng)酸堿或高離子強(qiáng)度引起的屏蔽效應(yīng)、AuNPs的團(tuán)聚現(xiàn)象等均會抑制FRET猝滅效率。由圖4B可知，加入10 μL ICP-Aptamer時，體系的熒光抑制率達(dá)到最大，這可能是因?yàn)镮CP-Aptamer與DNA的雜交趨于飽和，繼續(xù)增加ICP-Aptamer含量，體系熒光抑制率基本不變。當(dāng)溫育時間和溫育溫度分別為10 min（圖4C）和60℃（圖4D）時，體系熒光抑制率達(dá)到最大值。

3.5?“開-關(guān)”型熒光探針對水胺硫磷的靈敏檢測

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，將“開-關(guān)”型熒光探針用于水胺硫磷的檢測。如圖5所示，在0.02～10 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著水胺硫磷濃度的增大，檢測體系在518 nm處熒光值逐漸降低，熒光抑制率與水胺硫磷濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.015x + 0.769 （R2=0.998），檢出限（LOD）為17.8 nmol/L （3σ），低于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法 （表1）。

3.6?“開-關(guān)”型熒光探針對水胺硫磷的選擇性

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，測定“開-關(guān)”型熒光探針對水胺硫磷、毒死蜱、敵敵畏、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、三唑磷、敵百蟲、啶蟲脒、吡蟲啉等農(nóng)藥的熒光信號，水胺硫磷的濃度為5 μmol/L，其它農(nóng)藥的濃度為50 μmol/L。 如圖6所示，對水胺硫磷，檢測體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，熒光抑制率為84%，檢測其它農(nóng)藥時，檢測體系熒光強(qiáng)度均無明顯變化，熒光抑制率較低。結(jié)果表明，“開-關(guān)”型熒光探針對水胺硫磷有較好的選擇性與特異性，這主要?dú)w因于ICP-Aptamer特有的核苷酸序列，以及特異性結(jié)合靶標(biāo)前后特有的二級、三級結(jié)構(gòu)，即ICP-Aptamer對水胺硫磷所具有的特異性識別的莖、環(huán)結(jié)構(gòu)以及在特異性識別過程中結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)與折疊等[24]。

3.7?大米、菠菜樣品中水胺硫磷的檢測

采用“開-關(guān)”型熒光探針檢測大米、菠菜樣品中的水胺硫磷，評估其在檢測實(shí)際樣品中水胺硫磷的可行性。同時，采用氣相色譜法（GC）測定水胺硫磷含量。大米、菠菜樣品中未檢出水胺硫磷，5個添加水平下的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，回收率為92.9%～107.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4.2%，檢測結(jié)果與GC方法一致。結(jié)果表明，本研究建立的基于適配體/金納米粒子的“開-關(guān)”型熒光探針用于水胺硫磷含量的測定，具有較好精確度和準(zhǔn)確度。

4?結(jié) 論

基于水胺硫磷的適配體和金納米粒子，制備了“開-關(guān)”型熒光探針，在0.02～10 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，水胺硫磷濃度與熒光抑制率呈良好的線性關(guān)系。將此探針用于大米和菠菜樣品中水胺硫磷的檢測，其結(jié)果與氣相色譜法具有較好的一致性。此熒光探針具有檢出限低、操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，在農(nóng)藥等痕量物質(zhì)的分析測定中具有良好的應(yīng)用前景。

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